Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 3:46 min. • March 31st, 2026
Comienza con muestras bacterianas pretratadas con concentraciones crecientes de un antibiótico que elimina bacterias susceptibles.
Añade un medio de crecimiento que contenga óxido de deuterio y la misma concentración de antibiótico a los tubos correspondientes.
Incuba los tubos en condiciones de agitación.
El óxido de deuterio entra en las células bacterianas, donde el deuterio se incorpora en biomoléculas recién sintetizadas, formando enlaces carbono-deuterio.
Centrifuga las bacterias, descarta el sobrenadante y lava.
Añade un fijador para preservar la estructura bacteriana.
Añade agua, centrifuga y quita el sobrenadante.
Resuspende la bacteria y transfiere la suspensión a un tapa recubierto de poli-Llisina, luego sellalo.
Coloque la muestra en el escenario de un microscopio de dispersión Raman estimulada precalibrado o SRS. Añade agua y baja el objetivo.
Adquiere imágenes de múltiples campos para evaluar la frecuencia vibracional carbono-deuterio.
A concentraciones más altas de antibióticos, la señal carbono-deuterio disminuye, lo que indica una viabilidad bacteriana reducida.
Esto permite una evaluación rápida de la susceptibilidad a los antibióticos correlacionando la intensidad de la señal SRS con la viabilidad bacteriana.
Tras 1 hora de incubación, añadir 700 microlitros de antibiótico diluido en serie con un medio MHB al 100% de deuterio a los 300 microlitros de bacterias pretratadas con antibióticos en la misma concentración. Homogeneiza la mezcla pipeteando varias veces arriba y abajo. Añadir 700 microlitros de medio MHB libre de antibióticos al 100% a 300 microlitros de bacterias libres de antibióticos como control positivo.
Añadir 700 microlitros de deuterio sin antibióticos al 0% de MHB medio a 300 microlitros de bacterias libres de antibióticos como control negativo. Incubar todos los microtubos a 37 grados Celsius y 200 rotaciones por minuto durante 30 minutos. Tras la incubación, centrifugar la muestra de 1 mililitro de bacterias tratadas con antibiótico y deuterio a 6.200 veces g durante 5 minutos a 4 grados Celsius. Luego, lava el pellet dos veces con agua purificada. Fija las muestras en una solución de formalina del 10% de volumen por volumen y guárdalas a 4 grados Celsius.
Para la preparación de la muestra, lava 1 mililitro de solución bacteriana fija con agua purificada y centrifuga la solución bacteriana lavada a 6.200 veces g durante 5 minutos a 4 grados Celsius.
Retira el sobrenadante y enriquece la solución bacteriana hasta unos 20 microlitros con agua esterilizada. Deposita la solución bacteriana sobre un vaso cubierto de poli-L-lisina, sándwich con otro vaso de cubierta y sella la muestra. Coloca la muestra bacteriana en la etapa de muestra bajo el objetivo de inmersión en agua 60x. Inicia la imagen SRS de muestras bacterianas. Imagina al menos tres campos de visión para cada muestra.