Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 2:36 min. • March 31st, 2026
Toma una suspensión de una bacteria patógena aislada de una planta infectada.
El genoma bacteriano contiene una fusión transcripcional, en la que el promotor de un gen regulador de la virulencia también impulsa la expresión de un gen proteico fluorescente posterior y sin promotor.
Durante la infección vegetal, la activación del promotor desencadena la producción de proteínas reguladoras y fluorescentes.
La proteína reguladora activa los genes de virulencia, mientras que la fluorescencia proporciona una lectura medible de la activación de la virulencia.
Centrifugar las celdas, descartar el sobrenadante y luego volver a suspender para obtener una suspensión concentrada.
Coloca una gota sobre una capa de cobertura y cubre con una almohadilla de agarosa para dispersar e inmovilizar las células.
Captura una imagen de campo claro para identificar todas las células bacterianas y luego una imagen de fluorescencia para detectar fluorescencia de una sola célula.
Combina ambos para visualizar diferencias de intensidad de fluorescencia, que revelan subpoblaciones con alta, baja o nula expresión génica de virulencia.
Esta variación fenotípica refleja una estrategia adaptativa que mejora la supervivencia bacteriana durante la colonización vegetal.
Para un análisis de célula única, prepare una solución de agarosa al 1,5% en agua destilada. Una vez derretido, añade suficiente volumen para rellenar el espacio entre dos portaobjetos de microscopía colocados uno al lado del otro y coloca otro portaobjetos encima. Déjalos conducir durante 15 minutos y quita cuidadosamente el deslizador colocado en la parte superior.
Con una hoja, corta la almohadilla de agarosa en piezas de 5 milímetros por 5 milímetros antes de usarla. Paralelamente, centrifugar 1 mililitro de la bacteria extraída del apoplasto. Retira cuidadosamente el sobrenadante usando una pipeta y vuelve a suspender el pellet en 20 microlitros de agua para concentrar las células.
Coloca una gota de 2 microlitros de las celdas concentradas sobre una cubierta de 0,17 milímetros y cubre la gota con un trozo de almohadilla de agarosa. Visualiza la preparación bacteriana bajo el microscopio confocal para identificar bacterias fluorescentes verdes usando láseres específicos. Identifica todas las bacterias usando el campo claro y fusiona ambos campos.