Extracción de ADN total de hojas para la detección de infecciones bacterianas

0 vistas5:12 min • March 31st, 2026

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Comienza con pequeños trozos de tejido foliar frío en los que el floema está infectado con un patógeno bacteriano.

Coloca las piezas en un mortero con nitrógeno líquido para inhibir la actividad de nucleasas degradadoras del ADN.

Haz el triturado para alterar mecánicamente las células y liberar componentes intracelulares.

Usa una espátula fría para transferir el polvo, añade un buffer de lisis y haz un vórtice en la suspensión.

Incubar para lisar núcleos de plantas y células bacterianas, liberando ADN y ARN mientras desnaturalizan proteínas.

Añade RNasa e incuba para degradar ARN.

Añade un tampón de precipitación de proteínas a las proteínas agregadas y luego centrifuga para separarlas.

Transfiere el ADN vegetal y bacteriano que contiene sobrenadante a isopropanol para precipitar el ADN en cadenas filiformes.

Centrifugadora para recoger ADN y desechar el sobrenadante.

Lava con etanol, luego centrifuga y desecha el sobrenadante.

Seca el ADN al aire, luego añade un tampón de rehidratación e incuba para disolverlo.

Las muestras de ADN ya están listas para la detección posterior de patógenos basada en PCR.

Usa tijeras limpias para cortar una hoja entera fresca de un árbol cítrico y colócala en una bolsa de plástico limpia para bocadillos. Luego, enfría un mortero añadiendo una pequeña cantidad de nitrógeno líquido. Después, utiliza las tijeras para cortar pequeños trozos del tejido foliar, de aproximadamente una pulgada cuadrada.

Coloca los trozos de hoja en el mortero para congelarlos inmediatamente. Empieza rápidamente a moler el tejido foliar con el mortero hasta que el nitrógeno líquido se evapore y quede un polvo verde fino. Después, enfría una espátula metálica en nitrógeno líquido durante 10 a 15 segundos. Luego usa la espátula fría para extraer el tejido molido del mortero en un tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros. Utiliza una pipeta de 1000 microlitros para añadir 600 microlitros de solución de lisis de núcleos a la muestra. Luego se hace un vórtice en la muestra durante uno a tres segundos. Incuba el tubo a 65 grados Celsius, en baño maria durante 15 minutos.

Una vez finalizado el periodo de incubación, utiliza una pipeta de 10 microlitros para añadir 3 microlitros de solución de RNasa al lisato y eliminar ARN. Luego, mezcla el contenido del tubo invirtiéndolo de dos a cinco veces. Incuba a 37 grados Celsius durante 15 minutos en una incubadora en armario. Después de 15 minutos, añade 200 microlitros de solución de precipitación de proteínas a la muestra. Gira el tubo a alta velocidad durante 20 segundos.

Después, centrifuga la muestra a 13.000 g durante 3 minutos. Durante la centrifugación, añadir 600 microlitros de isopropanol mantenido a temperatura ambiente a un nuevo tubo micro-centrifugador de 1,5 mililitros. Tras finalizar la centrifugación, retira cuidadosamente el sobrenadante del tubo de la centrífuga al tubo que contiene isopropanol. Descarta la bola.

Invierte el tubo para que el ADN sea visible como una hebra hiláver. A continuación, centrifuga la muestra a 13000 g durante un minuto a temperatura ambiente.

Decanta el sobrenadante tras la centrifugación. Luego, añade 600 microlitros de etanol al 70% al pellet. Invierte el tubo varias veces para lavar el pellet. Centrifuga el tubo a 13000 g durante 1 minuto. Tras finalizar la centrifugación, aspira cuidadosamente el sobrenadante. Luego, invierte el tubo con la tapa abierta sobre un papel absorbente para que se seque al aire durante 15 minutos. Una vez seca, añade 100 microlitros de solución de rehidratación de ADN al pellet. Incuba la suspensión de ADN a 65 grados Celsius en un baño maria durante una hora.

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Última actualización: 15 agosto 2026