Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiología
0 vistas • 3:10 min • July 1st, 2026
Take a gelatin-coated coverslip and seed it with human primary endothelial cells. Incubate to allow cell adherence and proliferation.
Place the coverslip at the base of a micro-parallel plate flow chamber.
Attach the upper parts of the chamber.
Connect the inlet to a syringe filled with a calcium ionophore solution.
Perfuse the chamber with the solution.
The ionophore binds to calcium ions and transports them across the membrane, increasing intracellular calcium levels.
This triggers the release of a vesicle containing the von Willebrand factor (VWF), a glycoprotein.
VWF forms elongated strings on the cell surface under flow conditions.
Now, perfuse fluorescently labeled bacteria through the inlet to apply a fluid flow that mimics shear stress in blood vessels.
The bacteria bind to VWF via surface adhesins.
Wash with a buffer to remove unbound bacteria.
Using fluorescence microscopy, image and quantify bacterial adhesion to the host cells.
For experiments with endothelial cells, coat plastic slips with one milliliter of a 1% gelatin solution in PBS and incubate them for 30 minutes at 37 degrees Celsius.
Then, seed human umbilical vein endothelial cells on the gelatin-coated plastic slips and grow them to 70 to 80% confluency. Mount the endothelial cell-coated plastic slip in the bottom part of the flow chamber. Then, connect the inlet and outlet tubing to the upper part of the flow chamber and connect the outlet tubing to a waste container.
Gently place the upper part of the flow chamber on the bottom part and assemble the flow chamber while avoiding the formation of air bubbles. Inject one milliliter of medium through the chamber to make sure that the chamber is not leaking and to remove excess coating solution.
Next, set up the infusion pump for a one milliliter syringe so that it flows at 75 microliters per minute. Working in a dark room, fill a one milliliter syringe with one milliliter of fluorescently labeled bacteria and place it into the infusion pump. Connect the outlet of the syringe to the inlet of the flow chamber.
Taking care to avoid air bubbles, start the infusion pump for 10 minutes at 75 microliters per minute. After 10 minutes, remove the first syringe and connect a one milliliter syringe containing PBS or DMEM to the inlet tube. Start the infusion, pump, and rinse for 10 minutes to wash away any unbound bacteria.
Once rinsed, leave the infusion pump on and take at least 15 black and white images using an exposure time of 1.5 seconds in random locations, spread over the coated surface of the flow chamber.
Resumen
Este artículo presenta un protocolo detallado para estudiar la adhesión bacteriana a la pared del vaso sanguíneo bajo condiciones de flujo, utilizando una cámara de flujo de placas paralelas microscópicas sembrada con células endoteliales primarias humanas. El método permite la visualización y cuantificación de las interacciones bacterianas con el endotelio, simulando el estrés cortante fisiológico presente en los vasos sanguíneos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Biología celular
- Biología vascular
Antecedentes
- La adhesión bacteriana al endotelio vascular es un paso crítico en la patogénesis de muchas infecciones.
- Las condiciones de flujo de cizalladura en los vasos sanguíneos influyen en las interacciones entre el huésped y el patógeno.
- El factor de von Willebrand (VWF) es liberado por las células endoteliales y puede mediar la unión bacteriana.
- Los modelos in vitro son esenciales para desentrañar los mecanismos de adhesión bacteriana bajo condiciones controladas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar y demostrar un modelo in vitro reproducible para estudiar la adhesión bacteriana a células endoteliales bajo flujo.
- Visualizar y cuantificar la interacción entre bacterias y VWF en células endoteliales activadas.
- Imitar las condiciones fisiológicas de estrés por cizalladura presentes en los vasos sanguíneos.
Métodos Utilizados
- Recubrimiento de cubreobjetos o láminas de plástico con gelatina para favorecer el crecimiento de células endoteliales.
- Siembra y cultivo de células endoteliales primarias humanas (por ejemplo, HUVECs) hasta alcanzar confluencia.
- Ensamblaje de una cámara de flujo microscópica de placas paralelas con láminas recubiertas de células endoteliales.
- Perfusión con un ionóforo de calcio para activar las células endoteliales e inducir la liberación de VWF.
- Perfusión de bacterias marcadas con fluorescencia a través de la cámara bajo flujo controlado (75 µL/min durante 10 minutos).
- Lavado con tampón para eliminar bacterias no unidas.
- Microscopía de fluorescencia para obtener imágenes y cuantificar las bacterias adheridas.
Resultados principales
- Activación exitosa de las células endoteliales y liberación de VWF bajo condiciones de flujo.
- Formación de filamentos de VWF en la superficie endotelial, que proporcionan sitios de unión para las bacterias.
- Las bacterias marcadas con fluorescencia se adhieren al VWF mediante adhesinas de superficie bajo estrés de cizalladura.
- El análisis cuantitativo mediante imágenes permite evaluar la adhesión bacteriana en múltiples ubicaciones sobre la superficie de la cámara.
Conclusiones
- El modelo descrito simula eficazmente la adhesión bacteriana a la pared del vaso sanguíneo bajo flujo fisiológico.
- Permite el estudio detallado de las interacciones entre huésped y patógeno que involucran VWF y adhesinas bacterianas.
- Este enfoque puede adaptarse para diversas cepas bacterianas y tipos de células endoteliales para investigar los mecanismos de infección vascular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La modelización de la adhesión bacteriana a células endoteliales humanas bajo flujo fisiológico es fundamental para reducir los riesgos de hipótesis iniciales sobre dianas antiinfecciosas y para aclarar los mecanismos de interacción huésped-patógeno. Este sistema de cámara de flujo microscópica con placas paralelas permite la evaluación cuantitativa y reproducible de eventos de unión bacteriana, lo que refuerza la confianza predictiva en los modelos de infección vascular. El enfoque orienta las decisiones del portafolio al proporcionar datos relevantes para la traslación sobre mecanismos de adhesión y puntos de intervención.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la investigación mecanicista de las vías de adhesión bacteriana bajo esfuerzo cortante controlado.
- Apoya la validación funcional de dianas del huésped y del patógeno implicadas en la colonización vascular.
- Proporciona datos cuantitativos para reducir los riesgos de estrategias terapéuticas antiadhesión.
- Facilita la selección de dianas candidatas basada en fenotipos de adhesión.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Establece un ensayo estandarizado y reproducible para cuantificar las interacciones bacteria-endothelio.
- Proporciona resultados cuantitativos robustos adecuados para el cribado comparativo de cepas bacterianas o inhibidores.
- Permite la escalabilidad del ensayo y la reutilización de la plataforma para diversas combinaciones huésped-patógeno.
- Apoya el cribado posterior de compuestos antiadhesión o biológicos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Alinea los datos de adhesión in vitro con modelos vasculares relevantes para la enfermedad.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de estrategias antiinfecciosas.
- Permite el avance ajustado al riesgo de candidatos dirigidos a mecanismos de infección vascular.
- Apoya la identificación de biomarcadores para estudios traslacionales de las interacciones entre el huésped y el patógeno.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este modelo se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica al permitir la prueba de hipótesis, el desarrollo de ensayos y la validación traslacional de los mecanismos de adhesión bacteriana.
- Biología del Descubrimiento: Apoya el análisis basado en hipótesis de las vías de adhesión y las interacciones huésped-patógeno.
- Tamizaje: Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles de adhesión para la evaluación de candidatos.
- Análisis: Permite la comparación estadística de la adhesión bajo condiciones definidas de flujo y activación.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos in vitro con modelos preclínicos de infección vascular.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma modular adaptable a diversos tipos de células bacterianas y endoteliales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas y la reducción del riesgo mecanicista en las vías de adhesión.
- Valor operativo: Proporciona flujos de trabajo de ensayos estandarizados, reproducibles y escalables.
- Valor estratégico: Informa las decisiones de continuar o no continuar y reduce el riesgo biológico en fases avanzadas en carteras de agentes antiinfecciosos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos que actúan sobre la adhesión vascular.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de células endoteliales y manejo de cámaras de flujo.
- Necesita microscopía de fluorescencia e infraestructura para imágenes cuantitativas.
- Exige estandarización entre equipos en el montaje del ensayo y el análisis de datos.
- Adaptable a diferentes cepas bacterianas y fuentes de células endoteliales, según lo indicado en el protocolo.
- Limitado a modelos in vitro; la complejidad fisiológica puede requerir validación complementaria in vivo.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Ensayos de flujo laminar para investigar el reclutamiento leucocitario en cultivos de células vasculares y las plaquetas adherentes
Videos relacionados
0 Vistas
Un modelo In Vitro de un sistema de placas paralelas de la perfusión para el estudio de adherencia bacteriana a los tejidos de injerto
Videos relacionados
0 Vistas
Infección por neumococo de células endoteliales humanas primarias en flujo constante
Videos relacionados
0 Vistas
La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana
Videos relacionados
0 Vistas
De placas paralelas de flujo y la Cámara de circuito de flujo continuo para evaluar las células progenitoras endoteliales bajo una tensión cortante de flujo laminar
Videos relacionados
0 Vistas
Evaluación de la unión neumocócica a células endoteliales humanas primarias bajo flujo constante de medios
Videos relacionados
0 Vistas
Modelo in vitro de flujo paralelo de placas para estudiar la adhesión bacteriana en una biopsia tisular
Videos relacionados
0 Vistas
An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion
Videos relacionados
0 Vistas
Un ensayo de adhesión de flujo para estudiar Leucocyte Reclutamiento para hepático humano sinusoidales endotelio en condiciones de estrés de cizalla
Videos relacionados
0 Vistas
Ensayo de adhesión de neutrófilos Cámara de flujo humano
Videos relacionados
0 Vistas
Última actualización: 29 agosto 2026