Plaque Assay–Based Quantification of Viral Load in an Infected Mouse Tissue Sample
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiología
0 vistas • 3:40 min • July 1st, 2026
Take epithelial cell monolayers. Add diluted supernatants from a virus-infected mouse tissue homogenate.
Incubate for viral adsorption, then wash.
Cover the cells with agar-containing medium, forming a semisolid overlay, and incubate.
The virus enters cells, replicates, and lyses them, releasing new viruses.
The solidified agar restricts viral spread, forming clear zones called plaques.
Remove the overlay. Treat with a fixative to inactivate viruses.
Add a permeabilization buffer to disrupt cell membranes.
Add a blocking buffer to prevent non-specific interactions.
Add primary antibodies. Incubate to allow their interactions with viral nucleocapsid proteins.
Wash and add biotin-conjugated secondary antibodies that bind to the primary antibodies.
Rinse and introduce avidin-biotin-peroxidase complexes, which bind to biotin on the secondary antibodies.
Add chromogenic substrates that react with peroxidase to produce brown precipitates, which stain the plaques.
Count the plaques at different dilutions to quantify the viral load in the tissue sample.
Utilizing the supernatant obtained from the tissue homogenates, perform tenfold serial dilution and infect confluent monolayers of Vero E6 cells with one milliliter of each supernatant dilution in triplicates.
Let the virus adsorb for one hour at 37 degrees Celsius in a humidified 5% carbon dioxide incubator. Once done, wash the cells with one milliliter of 1X PBS and then incubate the cells in two milliliters of post-infection media containing 1% agar in the humidified 5% carbon dioxide incubator at 37 degrees Celsius for 72 hours. After the incubation, inactivate the plates in 10% neutral buffered formalin for 24 hours at four degrees Celsius, ensuring the entire plate is submerged.
Take plates out of biosafety level three and wash the cells three times with one milliliter of 0.5% Triton X-100 for 10 minutes at room temperature. Next, block the permeabilized cells with one milliliter of 2.5 bovine serum albumin or BSA and PBS for one hour at 37 degrees Celsius, followed by incubation in one milliliter of one microgram per milliliter of the SARS-CoV nucleocapsid protein cross-reactive monoclonal antibody 1C7C7 diluted in 2.5 BSA for one hour at 37 degrees Celsius. Wash the cells three times with one milliliter of 1X PBS and develop the plaques using the ABC and diaminobenzene, or DAB, peroxidase substrate kits according to the manufacturer's instructions, then calculate the viral titers as plaque forming units per milliliter.
Resumen
Este artículo detalla un protocolo para cuantificar cargas virales infecciosas de SARS-CoV-2 en muestras de tejido de ratones transgénicos K18 hACE2 mediante un ensayo de placas. El método consiste en infectar monocapas de células epiteliales con sobrenadantes de homogenatos de tejido, seguido de inmunotinción y conteo de placas para determinar los títulos virales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Virología
- Investigación de enfermedades infecciosas
- Ensayos virales cuantitativos
Antecedentes
- La cuantificación precisa del virus infeccioso en tejidos es esencial para evaluar la patogénesis viral y las intervenciones terapéuticas.
- Los ensayos de placa son un estándar de oro para medir partículas virales infecciosas.
- Los ratones transgénicos K18 hACE2 son un modelo ampliamente utilizado para estudios de infección por SARS-CoV-2.
- La inmunotinción mejora la visualización y la especificidad de las placas.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para cuantificar la infección por SARS-CoV-2 en tejidos de ratón.
- Permitir la medición reproducible de títulos virales mediante ensayos de placas y tinción inmunohistoquímica.
- Facilitar estudios sobre la patogénesis viral y la eficacia de intervenciones en modelos de ratón transgénicos.
Métodos Utilizados
- Preparación de homogeneizados de tejidos a partir de ratones infectados con virus.
- Dilución seriada en factores de diez de los sobrenadantes e infección de monocapas de células Vero E6.
- Incubación con una capa superior que contiene agar para restringir la diseminación viral y formar placas.
- Fijación, permeabilización y bloqueo de las células.
- Inmunotinción con anticuerpos primarios y secundarios conjugados con biotina dirigidos contra la proteína de nucleocápside viral.
- Visualización mediante complejo avidina-biotina-peroxidasa y sustrato cromogénico (DAB).
- Recuento de placas y cálculo de las titulaciones virales en unidades formadoras de placas por mililitro.
Resultados principales
- Se forman placas claras y contables en monocapas de células infectadas.
- La inmunotinción con anticuerpos específicos contra el nucleocápside mejora la detección de placas.
- Los títulos virales pueden cuantificarse con precisión a partir de muestras de tejido.
- El protocolo es reproducible y adecuado para entornos de laboratorio de alta contención.
Conclusiones
- El protocolo de ensayo de placas descrito permite la cuantificación precisa de SARS-CoV-2 infeccioso en tejidos de ratón.
- La inmunotinción aumenta la especificidad y la claridad de la visualización de las placas.
- Este método permite una evaluación robusta de estudios de infección viral e intervenciones en modelos de ratón transgénicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación basada en el ensayo de placas de la carga viral en tejido de ratón infectado proporciona una medida cuantitativa de referencia para el virus infeccioso, lo que permite una validación robusta del blanco terapéutico y una reducción del riesgo mecanicista en el desarrollo de antivirales&D. Este método permite la medición precisa de la replicación viral y la eficacia de las intervenciones, aportando información clave para las decisiones en las etapas tempranas del descubrimiento y preclínicas. Su reproducibilidad y especificidad son fundamentales para la selección de proyectos y la continuidad traslacional en las líneas de desarrollo de enfermedades infecciosas.
Aplicaciones Estratégicas en Biofármacos R&D
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación cuantitativa de hipótesis antivirales en modelos de ratón relevantes para la enfermedad.
- Apoya la validación funcional de dianas virales mediante la medición del rendimiento infeccioso.
- Proporciona una reducción mecanicista de riesgos al distinguir partículas virales infecciosas de las no infecciosas.
- Facilita una confianza predictiva en la interacción con la diana y los efectos de la intervención.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona lecturas cuantitativas validadas de carga viral para flujos de trabajo de cribado posteriores.
- Normaliza las condiciones del ensayo para garantizar la reproducibilidad y la comparabilidad entre estudios.
- Permite la escalabilidad y el reutilización de plataformas para la evaluación de compuestos en entornos de alta contención.
- Apoya el desarrollo robusto de ensayos mediante la detección de placas mejorada con inmunotinción.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con modelos in vivo relevantes para la enfermedad en el desarrollo traslacional de biomarcadores.
- Asegura la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de la eficacia antiviral.
- Reduce el riesgo en las decisiones de avance al proporcionar lecturas cuantitativas de infección.
- Apoya la comprensión mecanicista de la patogénesis viral en sistemas modelo.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este protocolo de ensayo de placas se integra desde el descubrimiento inicial hasta la investigación preclínica, permitiendo la verificación de hipótesis, el cribado y la validación traslacional en las líneas de investigación de enfermedades infecciosas.
- Biología del Descubrimiento: Cuantifica la producción viral infecciosa para apoyar la prueba de hipótesis y la reducción de riesgos biológicos.
- Tamizaje: Proporciona resultados de ensayos cuantitativos y reproducibles para la evaluación de compuestos.
- Analítica: Permite la comparación estadística de las cargas virales entre diferentes condiciones experimentales e intervenciones.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos in vitro e in vivo para alinear biomarcadores y eficacia.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma estandarizada y reutilizable para la cuantificación de virus infecciosos en diversos programas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva y validación de objetivos mediante lecturas cuantitativas de infección.
- Valor operativo: Asegura la estandarización, reproducibilidad y escalabilidad del ensayo en laboratorios de alta contención.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar y reduce el riesgo biológico en fases avanzadas en carteras de antivirales.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de candidatos antivirales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia y conocimientos especializados en virología, así como experiencia en procedimientos de alta contención (nivel BSL-3).
- Necesita acceso a instrumentación especializada para cultivo celular, inmunotinción y visualización de placas.
- Exige una estandarización rigurosa entre equipos para garantizar la reproducibilidad y la comparabilidad de los datos.
- Puede requerir adaptaciones para diferentes cepas virales o tipos de tejido, según lo indicado en el protocolo.
- Las limitaciones prácticas incluyen los requisitos de bioseguridad y las restricciones de capacidad inherentes al recuento manual de placas.
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Última actualización: 22 agosto 2026