Producción de pseudovirus mediante transfección de plásmidos en células humanas

Comience con un matraz de cultivo que contenga células de riñón embrionario humano en un medio rico en nutrientes.

Sustituya el medio por medio fresco que contenga cloroquina para mejorar la entrega del plásmido a las células.

Tome una mezcla de plásmidos que codifican proteínas de superficie de la influenza, proteínas del core lentiviral y el genoma lentiviral, junto con fosfato de calcio. Incube para formar complejos de ADN con fosfato de calcio.

Agregue la mezcla a las células y mezcle suavemente. Incube para permitir que el complejo ingrese a las células mediante endocitosis. El cloroquina favorece el escape endosomal del ADN plasmídico.

Dentro de la célula, el ADN plasmídico impulsa la expresión de componentes tanto de influenza como de lentivirus.

Sustituya el medio para eliminar los complejos en exceso.

Incube para permitir que los componentes virales se ensamblen y broten como pseudovirus, los cuales se liberan en el medio de cultivo.

Recolecte el medio que contiene los pseudovirus y centrifúguelo para obtener un pellet de restos celulares.

Recolecte el sobrenadante que contiene el pseudovirus y almacénelo a bajas temperaturas para ensayos posteriores.

Para comenzar, prepare una suspensión simple de células HEK 293FT en medio DMEM completo. Añada diez mililitros de la suspensión simple de células a un matraz T75, seguido de incubación a treinta y siete grados Celsius.

Dos horas antes de la transfección, reemplace el medio antiguo con diez mililitros de medio completo fresco con cloroquina. Mezcle los reactivos y el ADN plasmídico según se describe en el manuscrito. Luego, transfiera esta mezcla al medio sobre las células y agite suavemente.

Después de la incubación, reemplace el medio con quince mililitros de medio DMEM completo fresco. Después de sesenta y cinco horas, recolecte el sobrenadante mediante centrifugación. Recopile el sobrenadante y distribúyalo en alícuotas.