Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 2:54 min. • August 31st, 2026
Tome un ojo extraído de un modelo murino con una barrera retiniana alterada, previamente inyectado con un virus asociado a adenovirus que porta el gen de la proteína verde fluorescente.
La barrera retiniana alterada permite que el AAV penetre en las células fotorreceptoras, donde el genoma viral se expresa para producir GFP, haciendo que las células sean fluorescentes.
Disecar el ojo para eliminar la córnea y el cristalino, dejando intacto el copa ocular.
Sumerja la copa ocular en una solución fijadora para preservar la estructura retiniana.
Transfiera la copa ocular secuencialmente a través de concentraciones crecientes de soluciones crioprotectoras. Posteriormente, incube en la concentración final para prevenir la formación de cristales de hielo.
Incruste el copa ocular en medio criogénico y congélelo.
Usando un criostato, seccione el copa ocular en rebanadas delgadas.
Monte la sección sobre un portaobjetos. Añada un tampón que contenga detergentes para permeabilizar el tejido y permitir el acceso de los anticuerpos durante la inmunotinción posterior.
Lave la sección. Trátela con una solución bloqueadora para prevenir interacciones inespecíficas de los anticuerpos durante la inmunomarcación.
La criosección retiniana está lista para procedimientos adicionales de inmunomarcado e imagen de fluorescencia. Las células fluorescentes positivas para GFP revelan una transducción viral exitosa, lo que indica permeabilidad retiniana.
Después de extraer los ojos de un animal inyectado y sacrificado, diseque los ojos para eliminar el cristalino y la córnea. A continuación, fije por inmersión el ojo diseccionado en paraformaldehído al 4% durante una hora. Después de una hora, crio-proteja los ojos en sacarosa al 10% durante otra hora a temperatura ambiente. Luego, sumerja los ojos en sacarosa al 20% durante un tercio de hora a temperatura ambiente.
Finalmente, deje los ojos en solución de sacarosa al 30% durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, incluya y congele las copas oculares en una resina de inclusión como cryo matrix. Luego, utilizando el criostato, realice secciones de 10 micrones y móntelas en portaobjetos preparados para tejido congelado.
Ahora permeabilice las secciones sobre los portaobjetos con detergente durante cinco minutos. A continuación, realice dos lavados breves en PBS. Luego bloquee los ojos durante una hora a temperatura ambiente.