Preparación de criosecciones retinianas de ratón para evaluar la permeabilidad retiniana al virus adenoasociado

Tome un ojo extraído de un modelo murino con una barrera retiniana alterada, previamente inyectado con un virus asociado a adenovirus que porta el gen de la proteína verde fluorescente.

La barrera retiniana alterada permite que el AAV penetre en las células fotorreceptoras, donde el genoma viral se expresa para producir GFP, haciendo que las células sean fluorescentes.

Disecar el ojo para eliminar la córnea y el cristalino, dejando intacto el copa ocular.

Sumerja la copa ocular en una solución fijadora para preservar la estructura retiniana.

Transfiera la copa ocular secuencialmente a través de concentraciones crecientes de soluciones crioprotectoras. Posteriormente, incube en la concentración final para prevenir la formación de cristales de hielo.

Incruste el copa ocular en medio criogénico y congélelo.

Usando un criostato, seccione el copa ocular en rebanadas delgadas.

Monte la sección sobre un portaobjetos. Añada un tampón que contenga detergentes para permeabilizar el tejido y permitir el acceso de los anticuerpos durante la inmunotinción posterior.

Lave la sección. Trátela con una solución bloqueadora para prevenir interacciones inespecíficas de los anticuerpos durante la inmunomarcac