JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiología
0 vistas • 2:24 min • August 31st, 2026
Comience con el ojo de un ratón transgénico previamente inyectado con un virus asociado a adenovirus (AAV) que porta el gen de interés que codifica una proteína fluorescente.
El ratón carece de un gen esencial para mantener la integridad de la membrana limitante interna (ILM), una barrera que separa la retina de la cavidad vítrea.
La pérdida de este gen imita la degeneración retiniana, lo que permite que el virus penetre más profundamente en las capas celulares de la retina.
Las células retinianas infectadas expresan el gen de interés, produciendo proteínas fluorescentes, lo que les permite fluorescer.
Ahora, diseque el ojo y retire la córnea y el cristalino.
Desprenda cuidadosamente la retina del epitelio pigmentario de la retina (RPE) y de la esclerótica, la capa externa del ojo.
Sumerja el tejido en el fijador.
Lave con tampón fosfato para eliminar el fijador residual.
Cuando se observa bajo un microscopio confocal, la fluorescencia en las células retinianas indica una penetración viral exitosa a través de la membrana limitante interna comprometida.
Para montajes planos de retina, facilite la disección fijando los ojos enucleados en paraformaldehído al 4 % durante 15 a 30 minutos. Esta fijación, así como la fijación posterior a la disección, deben realizarse adecuadamente, ya que es fundamental para preservar la fluorescencia de GFP. Dentro de los 15 a 30 minutos del período de fijación, diseccione los ojos, retire la córnea y el cristalino.
Se pare la retina del epitelio pigmentario de la retina y de la esclerótica cortando alrededor de la ora serrata y del nervio óptico. Después de la disección, sumerja las retinas en paraformaldehído al 4 % durante otros 30 minutos para fijar el tejido y la proteína fluorescente en las células retinianas transducidas. Tras la fijación, lave la muestra durante cinco minutos en PBS estéril a pH 7,4.