JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiología
0 vistas • 3:24 min • August 31st, 2026
Tome tubos que contienen cápsidas virales, que son partículas similares al virus pero sin material genético.
Caliente los tubos a una temperatura constante durante diferentes duraciones.
Una duración más corta de calentamiento estresa levemente las proteínas del capsido, mientras que un calentamiento prolongado altera el capsido y provoca agregación.
Enfríe rápidamente los tubos para evitar cambios estructurales adicionales.
Transferir el líquido sobre una película de parafina.
Coloque una rejilla de microscopía electrónica de transmisión (TEM) sobre la gota. Los capsidos se adhieren a la superficie de la rejilla.
Retire el exceso de líquido del grid con un papel de filtro.
Lave con un tampón para eliminar los capsidos débilmente adheridos, luego seque nuevamente la rejilla.
Sumerja en acetato de uranilo, un tinción con metal pesado que se une a la superficie del capsido, haciendo que estos aparezcan más oscuros al microscopio electrónico de transmisión (MET).
Seque el portaobjetos y colóquelo sobre una placa. Guarde la placa en un desecador para eliminar la humedad.
Obtenga imágenes de la rejilla mediante TEM para visualizar el daño en los capsidos inducido por el calor.
Realice el tratamiento térmico como antes, sustituyendo PBS por HEPES 10 milimolar, pH 7,4, y sin diluir más los capsidos después del tratamiento. A continuación, pipetee la gota completa de 15 microlitros de la solución de capsidos tratada sobre la película de parafina. Tome el borde de la rejilla con pinzas, permitiendo que se cierren sobre el borde para sostener la rejilla, y coloque la rejilla con el lado de carbono hacia abajo encima de la gota de la solución tratada.
Deje que la rejilla incube durante 10 minutos para permitir que la cápside se adhiera a la rejilla. Dependiendo de la pureza de la preparación de la cápside, agregue lavados de la solución de HEPES en forma de gotas de 10 a 15 microlitros colocadas en línea después de la gota de cápside tratada. Después de 10 minutos, tome la rejilla con la gota.
Coloque la rejilla casi perpendicularmente sobre un trozo de papel de filtro para absorber la gota. Luego, utilice la rejilla para recoger la gota de tampón HEPES de 10 a 15 microlitros y manténgala durante 30 segundos. Después de 30 segundos de lavado, absorba con otro trozo de papel de filtro.
A continuación, coloque una gota de 15 µL de solución al dos por ciento de acetato de uranilo sobre la lámina de parafina en un área vacía. Tome la gota de acetato de uranilo con la rejilla y manténgala durante 45 segundos. Luego, retire el acetato de uranilo mediante absorción, asegurándose de eliminar la mayor parte de la solución.
Coloque la rejilla con el lado de carbono hacia arriba sobre un trozo de papel filtro, teniendo cuidado de que la rejilla no se adhiera a la humedad en las pinzas. Luego, coloque el papel filtro con la rejilla en una placa de Petri de vidrio abierta. Después de repetir este proceso para todos los tratamientos, coloque las mitades de la placa de Petri con las rejillas en un desecador durante la noche para secarlas antes de observarlas con microscopía electrónica de transmisión (TEM).