Phage Purification from Borrelia burgdorferi
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiología
0 vistas • 4:30 min • July 31st, 2026
Take a suspension of Borrelia burgdorferi bacteria infected with a borrelial phage.
Centrifuge the suspension and collect the supernatant containing phage particles and cellular debris.
Add a salt solution and incubate with shaking.
The salt solution enables the separation of residual host-derived macromolecules from the phage particles.
Centrifuge the suspension and collect the supernatant containing the phage particles.
Add polyethylene glycol or PEG, which acts as a molecular crowding agent that facilitates phage particle precipitation.
Incubate on ice and then centrifuge.
Discard the supernatant.
Resuspend the pellet in a buffer, then transfer it to a microcentrifuge tube.
Treat with chloroform to dissolve lipid-based cell debris.
Centrifuge the tube and collect the upper aqueous phase containing the borrelial phages.
Repeat the chloroform addition, mixing, centrifugation, and collection steps to ensure complete removal of contaminants.
Store the isolated phage particles under cold conditions for further use.
Supplement the prepared culture with the appropriate antibiotic concentration described in the manuscript, while incubating the sample at 33 degrees Celsius for 72 to 96 hours. To prepare solutions for PEG precipitation, prepare 500 milliliters of five molar sodium chloride, 500 milliliters of 40% PEG, and 100 milliliters of suspension medium as described in the manuscript. To sterilize, autoclave the solution, cool prior to use, and store at room temperature or four degrees Celsius.
For PEG precipitation of phage from the donor Borrelia burgdorferi clone, after 72 to 96 hours of incubation, centrifuge the samples at 8,000 g for 20 minutes at four degrees Celsius. Decant the supernatant into a clean, 50-milliliter conical tube and dispose of the cell pellet. Add five molar sodium chloride to a final concentration of one molar.
After mixing well, rock gently at room temperature for one hour. Centrifuge the samples at 8,000 g for 10 minutes at four degrees Celsius. After decanting the supernatant into a clean 50-milliliter conical tube as demonstrated previously, add 40% PEG-8000 solution to the supernatant to a final concentration of 10%. Mix well and set on ice for more than one hour, up to overnight.
Centrifuge the samples at 8,000 g for 20 minutes at four degrees Celsius as demonstrated previously. Discard the supernatant and remove as much excess liquid as possible without losing any pellet, which contains the phage particles. Resuspend the pellet in a minimal volume of suspension medium using the suspension medium to wash down the side of the bottle and collect any potential phage particles.
Treat the recovered phage sample with an equal volume of chloroform based on the volume of resuspension. Mix the sample well and centrifuge at 8,000 g for 10 minutes. Then, remove the aqueous layer to a clean tube, avoiding any of the thick interface layers.
After determining the volume recovered following the first chloroform treatment, again treat the sample with an amount of chloroform equal to 10% of that volume. Transfer the aqueous layer to a clean tube while being careful to avoid any of the interface or organic layers. Use the phage immediately or store it at four degrees Celsius.
Resumen
Este artículo detalla un protocolo para aislar partículas de fagos borrelias a partir de suspensiones de Borrelia burgdorferi mediante precipitación mediada por polietilenglicol (PEG) y extracción con cloroformo. El método permite a los investigadores obtener partículas de fagos purificadas para la manipulación genética posterior y el estudio del espiroqueto de la enfermedad de Lyme.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Biología Molecular
- Investigación sobre Bacteriófagos
Antecedentes
- Borrelia burgdorferi es el agente causal de la enfermedad de Lyme.
- La manipulación genética mediada por fagos es una herramienta valiosa para estudiar la genética bacteriana.
- El aislamiento eficiente de partículas fágicas es esencial para estudios genéticos y aplicaciones.
- La precipitación con PEG y la extracción con cloroformo son métodos establecidos para la purificación de fagos.
Objetivo del estudio
- Demostrar un protocolo confiable para aislar partículas de fagos borrelias de cultivos infectados de B. burgdorferi.
- Proporcionar pasos detallados para la purificación de fagos adecuada para experimentos de manipulación genética.
- Asegurar la eliminación de restos celulares y contaminantes de las preparaciones de fagos.
Métodos Utilizados
- Centrifugación de suspensiones infectadas de B. burgdorferi para separar el sobrenadante que contiene fagos.
- Añadición de solución salina para facilitar la separación de macromoléculas del huésped.
- Precipitación de partículas fágicas mediante PEG, seguida de incubación en hielo y centrifugación adicional.
- Extracción con cloroformo para eliminar restos basados en lípidos, con pasos repetidos para asegurar la pureza.
- Resuspensión del botón de fagos en tampón y almacenamiento en condiciones frías.
Resultados principales
- Aislamiento y concentración exitosos de partículas de fagos borrelias a partir de cultivos bacterianos.
- Eliminación eficaz de restos celulares y contaminantes mediante centrifugación secuencial y extracción con cloroformo.
- Preparación de fagos purificados adecuados para uso inmediato o almacenamiento en frío.
- El protocolo permite aplicaciones posteriores en la manipulación genética de B. burgdorferi.
Conclusiones
- El protocolo descrito permite el aislamiento eficiente y reproducible de partículas de fagos borrelias.
- La precipitación con PEG combinada con extracción con cloroformo produce preparaciones de fagos de alta pureza.
- Este método facilita estudios genéticos avanzados en B. burgdorferi y en investigaciones relacionadas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La purificación eficiente de partículas de fagos borrelias a partir de cultivos de Borrelia burgdorferi permite la manipulación genética precisa y estudios funcionales en la investigación de la enfermedad de Lyme. Esta capacidad respalda la validación temprana de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en carteras de enfermedades infecciosas. El aislamiento confiable de fagos sustenta protocolos reproducibles para el desarrollo de herramientas genéticas y la investigación traslacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la investigación de la función génica y el análisis de vías en B. burgdorferi.
- Apoya la reducción de riesgos biológicos al proporcionar fagos purificados para manipulación genética.
- Facilita la confianza predictiva en la validación de dianas mediante estudios genéticos controlados.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona stocks de fagos de alta pureza para ensayos genéticos estandarizados.
- Mejora la reproducibilidad y la producción cuantitativa en flujos de trabajo de cribado posteriores.
- Permite la preparación escalable de herramientas genéticas para plataformas de evaluación de compuestos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Apoya el desarrollo de modelos genéticos relevantes para la enfermedad en la investigación de la enfermedad de Lyme.
- Asegura la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante modificaciones genéticas precisas.
- Reduce la ambigüedad mecanicista en estudios traslacionales mediante la manipulación fágica confiable.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Este protocolo de purificación de fagos se sitúa en la interfaz entre el descubrimiento inicial y el desarrollo de herramientas genéticas, apoyando flujos de trabajo desde la prueba de hipótesis hasta la generación de modelos preclínicos.
- Biología del Descubrimiento: Permite la manipulación genética basada en hipótesis y la aclaración de vías en B. burgdorferi.
- Selección: Proporciona stocks de fagos reproducibles y de alta pureza para el desarrollo y validación de ensayos.
- Análisis: Ofrece mediciones cuantitativas de rendimiento de fagos y métricas de pureza para comparaciones entre condiciones.
- Investigación Traducional: Facilita la generación de cepas modificadas genéticamente para estudios relevantes a enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo estandarizado y reutilizable para la purificación de fagos en diversos proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la incertidumbre mecanicista en los estudios genéticos.
- Valor operativo: Estandariza la purificación de fagos para lograr reproductibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de continuar o descartar proyectos al permitir la generación robusta de herramientas genéticas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de los programas de investigación sobre enfermedades infecciosas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en biología de fagos y técnicas de microbiología molecular.
- Necesita acceso a infraestructura para centrifugación, almacenamiento en frío y manipulación de productos químicos.
- Exige estandarización entre equipos para obtener rendimientos y pureza de fagos reproducibles.
- Puede requerir adaptaciones para diferentes huéspedes bacterianos o tipos de fagos.
- Depende de pasos cuidadosos de separación de fases y eliminación de contaminantes.
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Última actualización: 29 agosto 2026