Métodos de desarrollo para el transporte de macrófagos transmitidas por la sangre de los medicamentos antirretrovirales Nanoformulated

El objetivo de este procedimiento es fabricar y evaluar la absorción celular, la secreción y las propiedades antirretrovirales de nanopartículas cristalinas antirretrovirales, a las que denominamos nano art. Esto se logra primero procesando los fármacos antirretrovirales mediante homogeneización por sonicación o molienda húmeda. El segundo paso del procedimiento consiste en caracterizar las propiedades físicas de las partículas nano art después de que los monocitos primarios se aíslan por centrifugación en contracorriente.

Se cultivan durante siete días en DMEM que contiene factor estimulante de colonias de macrófagos, o MCSF, que induce su diferenciación en macrófagos derivados de monocitos. El tercer paso consiste en evaluar la captación, retención y liberación de nano ART en macrófagos humanos derivados de monocitos. El paso final del procedimiento es evaluar la eficacia antirretroviral in vitro de nano ART en macrófagos derivados de monocitos.

En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la absorción facilitada y la liberación lenta de nano arte por parte de las células, así como una eficacia antirretroviral robusta. Estos parámetros se determinan mediante mediciones de los niveles de fármaco, por cromatografía líquida de alta eficacia o HPLC, y mediante pruebas en materiales sobrenadantes de cultivos infectados mediante la medición de la actividad de la transcriptasa inversa. Hola, soy Hanta Aldi y soy investigadora postdoctoral en el laboratorio del Dr. Howard Gelman en el Centro Médico de la Universidad de Nebraska.

Los métodos que presentamos pueden ayudar a responder preguntas clave en nanomedicina, como cómo los sistemas de administración de fármacos basados en células pueden utilizarse para desarrollar actividades de investigación traslacional. Esto puede lograrse mediante el uso de terapia antirretroviral formulada a nanoescala con semividas prolongadas. Nuestros estudios respaldan el uso potencial de la nano art en aplicaciones clínicas.

Hola, mi nombre es Ari Noche y soy estudiante becario MD PhD que trabaja en el Laboratorio de Neurociencia Emergente Carol Schwartz. Bajo la dirección del Dr. Gendelman, la implicación de las técnicas que les mostramos aquí se extiende a la terapia antirretroviral porque los compuestos formulados en nano pueden mejorar simultáneamente la biodisponibilidad y la farmacocinética, además de reducir los efectos secundarios relacionados con los medicamentos. Al tomar medicamentos antirretrovirales clínicamente disponibles y reempacarlos en nanopartículas, podríamos ser capaces de mejorar la adherencia y también afectar positivamente los resultados de la enfermedad.

Hola, soy el doctor Howard Gendelman. Soy un científico clínico y profesor, y presidente del Departamento de Farmacología y Neurociencia Experimental en el Centro Médico de la Universidad de Nebraska. Nuestro objetivo general es simplificar los medicamentos antirretrovirales para facilitar su disponibilidad y mejorar su biodistribución y farmacocinética.

Ahora les cedo la palabra a Ari y Sean, quienes los llevarán al laboratorio de investigación y les mostrarán cómo se realiza la fabricación y el desarrollo de estas nanopartículas. Aplicación clínica y desarrollo en el Centro Médico de la Universidad de Nebraska. Para fabricar nanoformulaciones mediante molienda húmeda, primero pese los cristales del fármaco y los diversos surfactantes que se utilizarán para preparar las nanoformulaciones, y mézclelos con tampón hepes 10 milimolar, pH 7,8, usando una mezcladora T 18 Ultra-Turrax hasta que se dispersen completamente. El porcentaje del fármaco en la formulación debe estar entre el 1 y el 2 % para la molienda continua.

Asegúrese de que el refrigerador y el compresor estén encendidos y de que la presión de salida sea de aproximadamente 100 PSI. Configure ahora el sistema para cargar el medio de molienda en el tanque y agregue 50 mililitros de perlas a la cámara de molienda. Utilizando un embudo, asegúrese de que no haya perlas en las roscas ni en ninguna parte fuera de la cámara de molienda para evitar fugas en el sello mecánico. Ahora, verifique que la junta tórica esté en su lugar en la cámara de molienda.

Luego, seleccione un tamaño adecuado de malla del tamiz y asegure las tapas apretando las tuercas. El tamaño de la malla del tamiz debe ser al menos la mitad del tamaño de las perlas. Utilice una malla de tamiz grande para evitar que el producto obstruya el filtro durante la molienda continua.

Después de bajar la cámara de molienda, agregue la suspensión del fármaco con diversas cantidades de surfactantes a la entrada del producto. El volumen mínimo de la suspensión debe ser de 100 mililitros. Esto evitará que la cámara de molienda se sobrecaliente y también evitará la contaminación de las perlas debido al menor desgaste de las piezas.

A continuación, encienda la bomba. Utilizando la unidad de control, varíe la velocidad de flujo según sea necesario para su formulación. Luego encienda el agitador y ajuste la velocidad en la unidad de control.

La velocidad puede aumentarse de 600 rotaciones por minuto a 4 320 rotaciones por minuto. En un entorno micro, supervise la temperatura mediante el medidor de temperatura que está conectado en la parte superior de la cámara de molienda para asegurarse de que no haya sobrecalentamiento. Ahora muela la muestra a diversas velocidades y caudales, y retire alícuotas pequeñas de aproximadamente un mililitro de la formulación para realizar mediciones de tamaño y carga utilizando un analizador zeta malvern por dispersión de luz láser.

Una vez alcanzado el tamaño deseado, detenga la molienda mediante la unidad de control y, con la bomba aún encendida, recoja la muestra en un matraz, permitiendo que el fármaco drene completamente. Recuerde apagar la bomba al finalizar y retire y limpie las perlas. A continuación, transfiera la suspensión del molino a tubos cónicos de 50 mililitros y configure la centrífuga a 10.000 rotaciones por minuto durante 30 minutos.

Tras finalizar el ciclo de la centrífuga, mida la cantidad de sate y sustitúyala por la misma cantidad de solución fresca de surfactante. Una vez completada la suspensión de Resus, transfiera la suspensión a la cámara de molienda y muela durante 10 minutos. Tome una alícuota de aproximadamente un mililitro y mida nuevamente el tamaño y la carga de la muestra utilizando el analizador de zeta potencial.

Finalmente, mida la concentración de las formulaciones de nanoarte utilizando HBLC para fabricar nanoarte mediante homogeneización. Con el Avastin Emulex C cinco, prepare los cristales del fármaco y los diversos tensioactivos como se describió anteriormente, y transfiera la suspensión al recipiente de homogeneización e inicie la recirculación. Asegúrese de que el refrigerador esté encendido antes de comenzar a homogeneizar la muestra.

Aumente gradualmente la presión hasta que el medidor indique 20 000 más o menos 2000 PSI y continúe homogeneizando hasta alcanzar el tamaño de partícula deseado. Esto generalmente toma entre 45 y 60 minutos. Tome periódicamente una alícuota de aproximadamente un mililitro y mida el tamaño y la carga de la muestra utilizando una centrífuga con analizador de zeta, tal como se describió previamente para la suspensión homogeneizada.

Luego, tras la suspensión en Resus, transfiera la suspensión al homogeneizador C cinco. Reinicie la circulación y restablezca la presión de homogeneización a 20 000 más o menos 2000 PSI y homogenice durante 30 minutos para fabricar mediante sonicación utilizando el procesador ultrasónico frío Palmer. Vierta la solución de cloro metano PLGA y fármaco en una solución de surfactante PVA al 1 % y coloque en un baño de hielo en el ultrasonido.

Inicie la sonicación al 50 % de amplitud, aunque la amplitud del sonicador puede reducirse a aproximadamente el 30 % para lotes más pequeños de muestras; sonicar la muestra durante 10 minutos. Tomar una pequeña alícuota para el análisis de tamaño de partícula. Si el tamaño de las partículas es mayor de 1,5 micrones, sonicar las muestras en intervalos de dos minutos hasta un máximo de 16 minutos en total.

Observe las muestras al microscopio con un aumento de 20 veces y documente las observaciones. Utilice una placa agitadora para crear un vórtice adecuado en la suspensión y continúe mezclando durante la noche a temperatura ambiente. Recoja la suspensión después de 24 horas y viértala en tubos cónicos de 50 mililitros.

Centrifugar las muestras a una velocidad de 8.000 rotaciones por minuto durante 20 minutos a cinco grados SIU, decantar el sobrenadante y resuspender una mitad de la muestra en 75 mililitros de agua filtrada por ósmosis inversa y la otra mitad en 75 mililitros de surfactante de bromuro de trimetil amonio al 0,5 %Ctal. Centrifugar nuevamente las muestras a una velocidad de 8.000 rotaciones por minuto durante 20 minutos a cinco grados Celsius y resuspender cada uno de los pellets con un total de 20 mililitros de solución de manitol. Finalmente, para partículas fabricadas mediante homogenización o sonicación, medir el tamaño de las partículas utilizando el analizador de zeta potencial y medir la concentración de las muestras utilizando HPLC.

Para prepararse para la visualización mediante microscopía, tome las suspensiones preparadas de nanoarte y sométalas a sonicación durante 10 segundos. Con una amplitud del 20 % y utilizando una sonda de sonicación, tome un cubreobjetos para microscopio y colóquelo sobre un microscopio invertido. Sobre el cubreobjetos.

Mezcle 15 microlitros de la suspensión de nanoarte con 100 microlitros de solución salina tamponada con fosfatos y mezcle pipeteando arriba y abajo varias veces. Luego, visualice las nanopartículas utilizando un objetivo de 20 aumentos para observar la morfología. Las muestras también pueden prepararse para su visualización mediante microscopía electrónica de barrido.

Aquí observamos imágenes obtenidas mediante microscopía electrónica de barrido de emisión de campo a bajo voltaje A-J-E-O-L Jsm 6 3 0 0 F tras el aislamiento de monocitos sanguíneos por centrifugación, utilizando monocitos purificados a una concentración de uno por 10 a la seis células por mililitro en DMEM suplementado con los siguientes aditivos. A continuación, se siembran dos por 10 a la seis células por pocillo en placas de seis pocillos dentro de una atmósfera humedecida, suplementada con 5% de dióxido de carbono, y se cultivan durante siete días para permitir que los monocitos se diferencien en macrófagos, con el fin de analizar la captación y recolección celular. Se mezcla el nanoart con el medio de cultivo hasta una concentración final de 100 micromolar y se añade un mililitro de medio de tratamiento a cada pocillo en el punto temporal deseado o cuando las células estén completamente cargadas con nanoart.

Retire todo el medio de tratamiento y lave las células tres veces con un mililitro de PBS para eliminar cualquier partícula que no haya sido incorporada por las células en un mililitro de PBS. Desprenda las células adherentes del fondo del pocillo utilizando un lifter celular y colóquelas en un tubo microcentrífugo de 1,7 mililitros. A continuación, centrifugue las células a 1000 RCF a cuatro grados Celsius durante 10 minutos.

Elimine el sobrenadante y agregue 200 microlitros de metanol al 100 % para lisar las células y disolver el nano art mediante sonicación breve del pellet con una sonda ultrasónica a una amplitud del 20 % durante dos a cinco segundos. Almacene las muestras a menos 80 grados Celsius hasta que estén listas para analizar el contenido del fármaco. La retención intracelular del nano art también se puede visualizar mediante microscopía electrónica de transmisión después de que las secciones se preparen con un microtomo, como se observa aquí.

Consulte el texto adjunto a este artículo para obtener detalles sobre cómo analizar el tratamiento de células con nanoarquitecturas, siguiendo el procedimiento descrito anteriormente para analizar la captación celular y la recogida. Sin embargo, en lugar de recoger las células tras el lavado, sustituya el PBS por dos mililitros de medio de cultivo celular sin MCSF y sin nanoarquitecturas en los días indicados o cuando el medio se vuelva amarillo, intercambie la mitad del medio en el día deseado. Recoja un mililitro del medio celular junto con las células replicadas y procéselos para el análisis del fármaco.

Para visualizar en tiempo real la absorción de nano arte mediante microscopía bifocal, tome primero un DRE como vibrant y agréguelo al medio. Siguiendo las instrucciones del fabricante, añada el medio que contiene el colorante a los macrófagos derivados de monocitos maduros y luego enjuague las células tres veces usando un mililitro de medio de cultivo para eliminar cualquier exceso de colorante. A continuación, mezcle el nano arte con el medio de cultivo utilizando nano arte marcado con fluorescencia y agregue el medio de tratamiento con el nano arte marcado. Inmediatamente antes de la adquisición de imágenes con un microscopio confocal, capture una imagen cada 30 segundos durante cuatro horas utilizando un objetivo de 60 aumentos.

Finalmente, se pueden realizar ensayos de infección e infectividad por VIH-1. Primero, trate las células como se describió para visualizar la liberación de art. Luego, en los días deseados, retire todo el medio y sustitúyalo por medio sin M-CSF que contenga VIH-1A a una multiplicidad de infección de 0,01 partículas virales por célula e incube durante 24 horas.

Luego, retire el medio viral y sustitúyalo por virus fresco, cultivando las células en medio libre durante 10 días, intercambiando la mitad del medio cada dos días o según sea necesario para mantener las células vivas durante 10 días posteriores a la infección. Recolecte 10 microlitros de medio de cada pocillo y colóquelos en una placa de 96 pocillos; almacene a menos 80 grados Celsius hasta que esté listo para realizar el análisis de transcriptasa inversa. También se pueden realizar detecciones posteriores de P24 del VIH-1.

Aquí podemos observar fácilmente la morfología de células expuestas al virus a una multiplicidad de infección de 0,01 un día después del tratamiento con nano arte. En estos macrófagos derivados de monocitos, no hay evidencia de infección viral y las nanopartículas son claramente visibles dentro del citoplasma celular. Aquí, las células fueron expuestas al virus 10 días después del tratamiento con nano arte.

Algunas de estas células estuvieron infectadas, como lo indica la tinción de P 24 y la formación de células gigantes multinucleadas, pero aún hubo una protección significativa en comparación con las células no tratadas. Obsérvese que las nanopartículas aún son visibles dentro del citoplasma de las células en B, aunque no tanto como en a; estas estructuras no están presentes en células que no fueron tratadas con nano art. En estos videos confocales de células vivas, observamos macrófagos marcados en verde y nano art marcado en rojo.

Aquí podemos observar que las células acumulan muy pocas nanopartículas. Aquí, acumulan rápidamente partículas, como indica el aumento de la fluorescencia roja. Estas diferencias son paralelas a los hallazgos observados al analizar la absorción de fármacos mediante HPLC; además, podemos ver que las células incorporan activamente las partículas.

La diferencia entre las tasas de acumulación de nanoarte celular refleja los efectos de características físicas como el tamaño, la forma y la carga sobre la capacidad de los macrófagos para captar y retener el nanoarte. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar nanoarte utilizando técnicas de homogeneización por molienda húmeda y sonicación. Estos son métodos eficaces para fabricar nanopartículas antirretrovirales.

La molienda húmeda y la homogeneización sirven para fraccionar partículas cristalinas de fármaco más grandes en nanopartículas más pequeñas dentro de surfactantes lipídicos, y una técnica de sonicación produce gotas individuales de fármaco de tamaño nanométrico dentro de un polímero. Aquí también hemos demostrado cómo utilizar macrófagos derivados de monocitos humanos como una plataforma de prueba para evaluar el transporte de nanoart. Nuestro método de prueba permite un cribado muy sencillo de la capacidad de una partícula para ser captada, retenida y liberada por las células, así como de su capacidad para inhibir la replicación viral.

Esto permite al investigador identificar arte nano que podría tener la mayor probabilidad de éxito in vivo y, en última instancia, de uso en humanos infectados. Los resultados completos de estos experimentos se publican en nuestro artículo Online Nano. El artículo se titula Combinaciones de Fármacos Antirretrovirales Formulados en Nano que Prolongan la Liberación de Fármacos y las Respuestas Antirretrovirales en Macrófagos Infectados con VIH-1, implicaciones para la Terapéutica de la Neuro SIDA en el Journal of Neuro Immune Pharmacology 2010.

Muchas gracias.