Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 2:30 min. • August 31st, 2026
Comience con organoides intestinales de ratón que han sido parcialmente disociados para facilitar la transducción lentiviral.
Tomar los vectores lentivirales en un medio de transducción.
El lentivirus porta un gen de interés para la integración estable en el genoma del huésped.
Agregue el lentivirus al pocillo.
Incube la mezcla para permitir la entrada viral.
El ARN viral se transcribe inversamente en ADN e integra en el genoma del huésped.
Añada medio de organoides y transfiera la mezcla a un tubo.
Centrifugar para eliminar cualquier virus no unido.
Mezcle el precipitado en una matriz de membrana basal.
Coloque los organoides en un pocillo y permita que se solidifiquen.
La matriz forma una red que atrapa a los organoides y proporciona soporte estructural.
Añada medio de organoides suplementado con promotores del crecimiento para favorecer la proliferación de los organoides.
Esto da como resultado organoides brotantes que contienen el gen transducido, los cuales pueden utilizarse para análisis funcionales posteriores.
Transfiera los organoides en esta última pequeña cantidad de medio a un pocillo de una placa de 48 pocillos.
Añada el lentivirus de alta titulación previamente preparado en medio de transducción a los organoides y resuspenda. Incube la mezcla de organoides y virus durante una hora a 37 grados Celsius en un incubador de cultivo para permitir la transducción. Después de una hora, añada un mililitro de medio de cultivo de organoides a la mezcla de organoides y virus, resuspenda y transfiera la mezcla a un tubo de microcentrifugado; centrifugue a 850 ×g durante cinco minutos.
Para obtener el sedimento de los organoides, retire el sobrenadante y resuspenda el sedimento en 20 microlitros de Matrigel frío. Coloque la gota en el centro de un pocillo. En una placa de 48 pocillos, incube a 37 grados Celsius durante 15 minutos para que la gota solidifique. Después de 15 minutos, agregue cuidadosamente 250 microlitros de medio de cultivo de organoides suplementado con nicotinamida e inhibidores de quinasas.