JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiología
0 vistas • 2:40 min • August 31st, 2026
Tome cultivos de células de cáncer de mama.
Co-infectar con dos tipos de adenovirus. Uno lleva un gen de proteína verde fluorescente o GFP bajo un promotor constitutivamente activo.
El otro contiene un gen reportero que codifica la proteína fluorescente roja o RFP, bajo un promotor sensible a SMAD.
Al cultivo de prueba, añada el factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta) e incube.
Los virus se unen al receptor para ingresar a la célula huésped, entregar los genes al núcleo y permitir la expresión de GFP.
En las células de prueba, el TGF-beta se une a su receptor y activa la vía SMAD mediante la fosforilación de las proteínas SMAD2 y SMAD3.
Estas proteínas forman un complejo con SMAD4.
Este complejo se une al promotor del gen reportero, permitiendo la expresión de RFP además de GFP.
En el control, la vía SMAD permanece inactiva, lo que permite a las células expresar únicamente GFP.
Capture imágenes fluorescentes de células vivas.
La presencia de ambas señales confirma la activación de la vía SMAD mediante la transducción dual con adenovirus.
El día de la infección con adenovirus, siembre las pocilas de una placa de 12 pocilas con aproximadamente 1,25 veces 10 a la quinta células MDA-MB-231 en 500 microlitros de medio para obtener una confluencia del 35 %. Infecte las células en todas las pocilas con 75 microlitros de adenovirus-CMV-GFP y 7,5 microlitros de adenovirus CAGA12-Td-Tomato para obtener una MOI de 2.500, lo que puede lograr una positividad de infección del 100 %. A continuación, agregue TGF-beta a la pocila de tratamiento inmediatamente después de la infección con adenovirus.
Incubar a 37 grados Celsius con 10 % de dióxido de carbono durante 24 horas. Al día siguiente, obtener imágenes de las células vivas con un microscopio de fluorescencia de contraste de fase.