Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 2:36 min. • August 31st, 2026
Comience con linfocitos humanos infectados con VIH-1 sobre un cubreobjetos montado en una portaobjetos.
Estas células han sido hibridadas con sondas que marcan fluorescentemente el ARN viral y el ADN proviral.
Incube las células en una solución bloqueadora para prevenir la unión no específica de anticuerpos.
Introduzca anticuerpos primarios dirigidos contra la proteína de la cápside del VIH-1.
Incube para permitir que los anticuerpos primarios se unan a la proteína de la cápside.
Lave las células con tampón para eliminar los anticuerpos no unidos.
Añada anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia que se unen a los anticuerpos primarios.
Lave los anticuerpos no unidos.
Añada un colorante específico para ADN para teñir los núcleos de las células, luego lave para eliminar el exceso de colorante.
Utilice imágenes de fluorescencia multiplexadas para detectar simultáneamente ADN viral, ARN, proteína y núcleos del huésped en colores distintos.
Esta visualización a nivel de célula individual permite el estudio de diferentes etapas del ciclo vital del virus mediante la visualización simultánea del ADN, ARN y proteínas virales en células infectadas.
Para la inmunomarcación de las proteínas de interés, tras el último lavado, tratar cada cubreobjetos con 200 microlitros de tampón bloqueador durante una incubación de una hora a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, deseche el tampón de bloqueo y agregue 200 microlitros del anticuerpo primario de interés diluido en PBS más Tween 20 suplementado con 1% de albúmina sérica bovina. Después de una incubación de una hora a temperatura ambiente, lave los portaobjetos con dos lavados de 10 minutos en PBS fresco más Tween 20 con agitación por cada lavado antes de etiquetar las muestras con un anticuerpo secundario adecuado durante una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave los portaobjetos dos veces con PBS fresco más Tween 20 durante 10 minutos con agitación por cada lavado.
Después del segundo lavado, contratiñir los núcleos con un colorante nuclear adecuado durante un minuto a temperatura ambiente, seguido de dos lavados en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación.