Una pantalla de alto rendimiento para Biominería actividad de celulasa de bibliotecas metagenómicas

El objetivo general de este procedimiento es identificar clones que expresan celulasa a partir de una biblioteca metagenómica. Esto se logra replicando primero una biblioteca metagenómica previamente hecha usando un robot después de la incubación de la biblioteca replicada a 37 grados Celsius durante 24 horas. Se mide el crecimiento de los clones de E. coli, se agrega la lisis, el tampón y el sustrato a la biblioteca replicada.

En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la actividad de la celulasa a través de mediciones de absorbancia colormétrica utilizando un lector de placas. Hola, soy Keith y trabajo del laboratorio de Steven Hallam en el Departamento de Microbiología e Inmunología de la Universidad de Columbia Británica. Hoy os mostraremos un procedimiento para el cribado funcional de alto rendimiento de bibliotecas metagenómicas.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la actividad de la biomina celulasa a partir de bibliotecas metagenómicas. Así que comencemos. Antes de comenzar este protocolo, prepare una biblioteca metagenómica almacenada en un formato de placa de 384 pocillos.

Este estudio utilizó el vector SMID de control de una copia PCC en combinación con células Farge T one resistente TRANSFECT max EPI 300 T one resistente a E. coli como anfitrión de la biblioteca para iniciar este procedimiento, retirar las placas que contienen la biblioteca a menos 80 grados Celsius y descongelarlas a 37 grados Celsius durante aproximadamente 20 minutos. Mientras tanto, use la función de esterilización con luz ultravioleta en el QIX two para esterilizar el robot durante 15 minutos. Configure el Q fill three según las instrucciones del fabricante con la botella de medios conectada al colector a través del programa de tubos estériles.

La Q llena tres para la cantidad adecuada de medios y configúrela para llenar un volumen de 45 microlitros. En cada uno de ellos, purgue bien el aire de la tubería y el colector utilizando la función de purga del robot hasta que el medio sea visible. En cada pin del colector, llene el número deseado de placas con medios LB utilizando el relleno Q tres.

Cada plato tarda aproximadamente 20 segundos en llenarse. A continuación, cargue las placas de la biblioteca y las placas nuevas en las áreas apropiadas de las selecciones Q. Para llenar los baños de limpieza con los reactivos adecuados.

2%Micro 90 en el baño trasero, agua destilada en autoclave en el baño central y 80%etanol en el baño delantero. Utilizando el programa de replicación del qix two, seleccione el cabezal adecuado, así como el número y los tipos de placas de origen y destino. También configure el cabezal para limpiar entre replicaciones.

Por lo general, seis ciclos en cada baño son suficientes. La capacidad de la máquina es de 10 placas a la vez. Configure la máquina para que funcione.

Tardará aproximadamente 15 minutos en replicarlo. Capacidad completa con una cabeza de 384 pines. Una vez que se hayan replicado las placas, cultive las placas a 37 grados centígrados durante 24 horas en una caja de humedad.

El tiempo de incubación prolongado es necesario ya que se induce un alto número de copias de smid con la adición de arabinosa. Mientras tanto, limpie el robot Q fill three como se describe en el protocolo escrito. Después de la incubación, retire las placas de la incubadora a 37 grados centígrados.

Deje a un lado las tapas y coloque las placas en la plataforma de carga del cargador provista con el apilamiento rápido. Asegúrese de realizar un seguimiento del orden de las placas, ya que el software no lo hace. Se leerán las placas en la parte inferior de la pila.

Primero, retira un cargador de la pila rápida. Asegúrese de que esté vacío y empújelo sobre la pila de platos para leerlo. Agarre el cargador por el mango y la placa debería cargarse en el cargador.

Cargue el cargador en la pila rápida en la orientación correcta. Abra el escaneo de su re programa en la computadora conectada. Seleccione nueva sesión y asígnele el nombre adecuado.

Elija llamar placa de 384 pocillos de fondo plano como la placa. Escriba en el área de diseño de la placa. Seleccione el botón del asistente y elíjalo para agregar 384 incógnitas a la placa.

En el área de protocolo, seleccione la opción bucle de pozo e introduzca para 384 pozos. Aparecerá un icono de bucle de pozo en el árbol de flujo en el lado izquierdo de la pantalla. Seleccione el icono y haga clic para agregar la medición fotométrica.

Configúralo para que lea a 600 nanómetros. Guarde el protocolo con un nombre único y cierre el escaneo de su reprograma. A continuación, abra el programa polara RS.

En la página principal hay una tabla que enumera los instrumentos conectados al dispositivo de pila rápida bajo el encabezado de escaneo VARI, haga clic en la opción de sesión de ejecución. A continuación, debería aparecer la ventana de ensayo con un diagrama de flujo en el centro. Seleccione el elemento de sesión de ejecución y, a continuación, busque el nombre del análisis guardado.

Se vuelve a ejecutar en el menú desplegable que aparece en el lado derecho de la pantalla. Una vez seleccionado el protocolo, haga clic en ejecutar. Con este ensayo, aparecerá un cuadro que preguntará qué revista usar como fuente y qué revista está vacía.

El recuadro inferior de la pantalla corresponde al fanzine frontal de la revista. Asegúrese de que tanto la pila rápida como el escaneo Vario estén activados y haga clic en iniciar. La pila rápida cargará automáticamente las placas en el lector de placas, lo que permite mediciones continuas de las placas.

Observe la primera carga de la placa en el escaneo Vario para asegurarse de que las máquinas deben leerse correctamente. 25 placas tarda aproximadamente 50 minutos. Una vez finalizado el escaneo de Barrios, retire el cargador completo y colóquelo en la plataforma de carga del cargador.

Levanta el rectángulo exterior de la plataforma y el cargador debe deslizarse, dejando las placas en una pila en el medio. Finalmente, reemplace las tapas de las placas para una pantalla basada en solución. Para la actividad de la celulosa primero, prepare la mezcla de ensayo utilizando un stock de lisis prefabricado 10 veces.

Mezcle 50 milimolares de tampón de acetato de potasio a pH 5.5 como se describe en el protocolo escrito. A continuación, prepare un caldo de hasta 75 miligramos por mililitro, DIFENILO cromogénico o sustrato biocida celular DNP en DMSO, asegurándose de que el sustrato esté completamente disuelto. Añada la solución madre de biocida celular DNP a la mezcla de ensayo hasta una concentración final de 0,1 miligramos por mililitro.

Tenga en cuenta que cada plato utiliza aproximadamente 20 mililitros de solución y se necesitan 50 mililitros adicionales para permitir el volumen muerto. Configure el relleno Q tres como antes en la mezcla de ensayo en cada placa utilizando el relleno Q tres. Cada plato tarda aproximadamente 20 segundos en llenarse.

Una vez añadida la mezcla de ensayo, incubar las placas a 37 grados centígrados durante 12 a 16 horas. En una caja de humedad, retire las placas de la incubadora a 37 grados centígrados. Deje a un lado las tapas y coloque las placas en la plataforma de carga del cargador provista con el apilamiento rápido de la misma manera que antes.

Abra el escaneo de su programa re y configúrelo como se hizo anteriormente con la excepción de la medición fotométrica, que debe configurarse para leer a 400 nanómetros. A continuación, introduzca los parámetros en el programa POLARA RS. Como se demostró anteriormente.

Permita que el Vario scan lea las placas. Después de la carrera, retire y deseche las placas. Para exportar las lecturas de absorbancia abiertas, escanéelo en el software y elija.

Abra un archivo existente. Seleccione el directorio donde se guardó la sesión y presione el ícono más para expandir la lista. Debajo del encabezado del título estarán las opciones etiquetadas como contenedor uno al contenedor N.Dependiendo del número de placas, seleccione la primera placa que se analizará en la barra de menú en la parte superior de la página, seleccione exportación de informe de datos.

Elija opciones para la exportación, como el diseño de la placa y los datos fotométricos. Haga clic en ver informe y, a continuación, en guardar archivo. Elija el directorio deseado.

El formato de salida es una hoja de cálculo de Microsoft Excel. Aquí, las lecturas de absorbancia de un solo 384. Placa de pocillo que contiene un clon positivo, como se muestra, los clones positivos muestran un marcado aumento en la absorbancia en comparación con los clones que no expresan actividad celulasa.

Las diferencias en el tiempo de ensayo, el pocillo, la ubicación en la placa o la concentración de DNP pueden afectar las lecturas de absorbancia absoluta. Las lecturas de absorbancia relativa, como la diferencia de absorbancia por encima del promedio de la placa o el promedio de la columna, son un método más sólido para identificar clones positivos para celulasa. Acabamos de mostrarte cómo identificar clones positivos para celulasa a partir de una biblioteca metagenómica.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar disolver el lado biológico de la célula DNP en DMSO e incubar las placas en una cámara de humedad. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.