Purificación de intasomas del virus espumoso prototipo mediante cromatografía de exclusión molecular

Comience con una suspensión que contenga precipitados de intasomas del virus espumoso prototípico o PFV, integrasas monoméricas, oligómeros de ADN y agregados proteicos.

Los intasomas de PFV son tetrámeros de integrasas virales complejados con oligómeros sintéticos que imitan el ADN genómico viral.

Agregue una solución salina a la suspensión e incube en hielo. La sal reduce la interacción electrostática entre los intasomas, lo que permite la solubilización de los precipitados.

Pipetee suavemente a intervalos regulares para favorecer la solubilización del intasoma.

Centrifugar para pelotar el precipitado restante y recoger el sobrenadante que contiene los intasomas solubles.

Tome una columna de cromatografía de exclusión por tamaño pre-equilibrada, empaquetada con perlas de agarosa reticulada, y cargue el sobrenadante sobre la columna.

Debido a su gran tamaño, los agregados proteicos y los intasomas evitan los poros de las perlas y eluyen antes.

Las integrasas monoméricas más pequeñas y los oligómeros entran en los poros de las perlas y eluyen más tarde.

Recolecte las fracciones eluidas tempranamente que contienen intasomas para su posterior análisis descendente.

Prepare dos puntas de pipeta de gran apertura eliminando de dos a cuatro milímetros del extremo de una punta de 200 microlitros con una cuchilla nueva de bisturí o afeitado sobre una superficie limpia. Retire el tubo de diálisis del tampón de diálisis. Para evitar la dilución de la muestra de intasoma con tampón de diálisis que pueda quedar en el extremo del tubo cerca del clip, utilice una micropipeta con una punta pequeña para eliminar cualquier exceso de tampón de diálisis.

Retire el clip de este extremo del tubo de diálisis. Al recuperar el ensamblaje, es importante recoger la mayor cantidad posible de la solución y del precipitado. Utilice la punta de pipeta de gran orificio para transferir la muestra, incluyendo el precipitado, dentro del tubo de diálisis, a un tubo de 1,5 mililitros sobre hielo.

Tenga en cuenta el volumen total del material recuperado. El volumen total es típicamente aproximadamente 140 µL. La muestra con el precipitado está a 200 mM NaCl.

Aumente la sal hasta una concentración final de 320 milimolar de cloruro de sodio mediante la adición del volumen apropiado de una solución stock de cinco molar de cloruro de sodio. Transfiera el recipiente con hielo y la muestra a una cámara fría de cuatro grados Celsius. Utilice la punta de pipeta de gran orificio para resuspender y solubilizar el precipitado mediante pipeteo.

Repita cada 20 minutos durante al menos una hora. La mayor parte del precipitado debería disolverse. Para purificar el intasoma, equilibre una columna de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de agarosa entrecruzada con tampón de funcionamiento SEC a un flujo de 0,4 mililitros por minuto.

Centrifugue la muestra de intasoma en una microcentrífuga a 14.000 × g durante 10 minutos a 4 °C para sedimentar cualquier precipitado restante. Después de retirar cuidadosamente el sobrenadante, cárguelo en un bucle de inyección de 200 µL. Aplique la muestra a la columna de SEC.

Eluir con 25 mililitros de tampón de funcionamiento de SEC y recoger 95 fracciones de 270 microlitros. Observar que el cromatograma de SEC muestra tres picos de A280 y A260.