Recolección de partículas del virus de la hepatitis E a partir de células de cáncer hepático humano

Comience con un cultivo de células de cáncer hepático humano transfectadas con ARN del virus de la hepatitis E (HEV) para producir partículas virales.

Algunos VHE adquieren una membrana endosomal de origen hospedador y salen de la célula, mientras que otros permanecen dentro de la célula como VHE no revestidos.

Para cosechar los HEV extracelulares, recolecte y filtre el sobrenadante del cultivo para eliminar los restos celulares.

Guarde a una temperatura ultra baja para preservar la infectividad.

Para cosechar los HEV intracelulares, lave las células con un tampón.

Añada tripsina-EDTA para desprender las células, luego agregue medio para detener la actividad enzimática.

Transfiera la suspensión a un tubo y centrifugue.

Deseche el sobrenadante que contiene trypsin residual. Reuspenda el precipitado y transfiéralo a un tubo.

Congele las células en nitrógeno líquido y désuelas sobre hielo.

Repita los ciclos de congelación-descongelación para lisar las células y liberar los virus.

Centrifugar, recolectar el sobrenadante que contiene los virus y almacenar a una temperatura ultra baja.

En el día seis, filtre el sobrenadante a través de una malla de 0,45 micrómetros para eliminar cualquier resto celular y almacene el virus de la hepatitis E derivado del cultivo celular extracelular recolectado a cuatro grados Celsius. Para la recolección de partículas virales intracelulares derivadas del cultivo celular, lave las células con PBS y desprenda las células con 1,5 mililitros de tripsina-EDTA al 0,05 % a 37 grados Celsius. Cuando las células se hayan desprendido, detenga la reacción con 8,5 mililitros de DMEM y transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 mililitros para la centrifugación.

Añada 1.6 mililitros de medio completo DMEM por electrotransferencia a tubos de reacción individuales de dos mililitros y use 800 microlitros del medio para resuspender las células, transfiriendo así las células a los tubos. Congele las células en nitrógeno líquido y luego descongele las células en hielo tres veces antes de centrifugar las lisados resultantes a alta velocidad durante 10 minutos a 10,000 veces g. A continuación, transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos sin perturbar los pellets de restos celulares para su almacenamiento a menos 80 grados Celsius.