Purificación del virus a partir del líquido alantoideo de huevos de gallina embrionados

Comience con un reservorio que contenga líquido alantoideo obtenido de huevos de gallina infectados con el virus.

Este fluido contiene partículas virales junto con contaminantes derivados del huésped.

Pase el fluido a través de un filtro de profundidad para capturar contaminantes grandes, mientras permite el paso de contaminantes más pequeños y de los virus.

Luego, cargue el líquido filtrado en un sistema de filtración, donde fluye tangencialmente a través de una superficie de membrana.

Los contaminantes más pequeños pasan a través de la membrana, mientras que el virus se retiene y concentra.

Cargue el virus concentrado en un gradiente de densidad y sométalo a centrifugación. El virus forma una banda distinta donde su densidad coincide con la del gradiente.

Recolecte la banda rica en virus en una cinta de diálisis y colóquela en un tampón. Los componentes del gradiente difunden hacia afuera, mientras que el agua del tampón difunde hacia adentro a través de la membrana semipermeable.

A continuación, coloque el casete en una solución hipertónica para extraer el agua y concentrar el virus purificado.

Para la purificación del virus de la enfermedad de Newcastle o NDV, primero prepare el sistema experimental previamente configurado haciendo pasar 50 mililitros de PBS a través de él.

Detenga la bomba cuando queden aproximadamente cinco mililitros de PBS en el tubo. A continuación, conecte un filtro de profundidad con una clasificación de retención de uno a tres micrómetros al tubo. Para ventilar el filtro, retire la segunda tapa del lado apical del filtro de profundidad y luego comience a pasar otros 50 mililitros de PBS a través del sistema.

Una vez que el PBS comience a fluir a través de la salida en la parte superior del filtro, cierre el puerto y continúe haciendo pasar PBS a través de las líneas. A continuación, reemplace el recipiente de desecho por un nuevo recipiente estéril de recolección y comience a hacer pasar el líquido alantoideo a través del filtro de profundidad. Luego, prepare el sistema de filtración tangencial o TFF en una configuración abierta y opérelo según se describe en el manuscrito.

Cuando queden aproximadamente cinco mililitros de líquido en el depósito, detenga la bomba y agregue líquido alantoideo filtrado por profundidad al depósito. Luego, reanude el flujo de la bomba. Para prevenir la degradación del virus, es importante asegurarse de que la presión del sistema no supere las 10 libras por pulgada cuadrada.

Para aumentar la elución, se debe utilizar una combinación de la velocidad de la bomba peristáltica y la pinza en C. Se dejan 150 a 100 mililitros de líquido alantoideo en el depósito, se detiene la bomba y se cambia el tampón añadiendo 150 a 200 mililitros de tampón ML. Nuevamente, se detiene la bomba cuando quedan cinco a diez mililitros de líquido en el depósito, luego se cierran las líneas de desecho utilizando dos pinzas en C.

Desconecte la línea de retenido que alimenta el depósito e insértela en un tubo cónico de 50 mililitros. Luego, reanude el flujo y haga una pausa cuando queden apenas unas gotas de líquido en el tanque del depósito. A continuación, retire las abrazaderas en C de las líneas de desecho y vuelva a conectar la línea de alimentación de retenido al tanque del depósito.

Mientras tanto, para preparar la ultracentrifugación en gradiente de densidad de yodixanol, primero agregue 0,5 mililitros de yodixanol al 40 % a un tubo de ultracentrífuga de pared delgada con extremo abierto de 13,2 mililitros. Luego prepare la columna con adiciones sucesivas de 2,5 mililitros de yodixanol al 20 % y 2,5 mililitros de yodixanol al 10 %. Antes de la ultracentrifugación, agregue cuidadosamente de seis a 6,5 mililitros de la solución vírica eluida del sistema de TFF a la columna de yodixanol sin alterar el gradiente.

Después de la ultracentrifugación, retire los tubos con un par de pinzas estériles. La banda objetivo debe ser una banda grande entre los gradientes del 10 y el 20%. A continuación, suspenda el tubo sobre la parte superior de un vaso de precipitados utilizando un soporte universal.

Después de eso, sujete una aguja de 1,5 pulgadas y calibre 18 a una jeringa de cinco mililitros, luego perfore el costado del tubo de ultracentrífuga con la aguja y extraiga la banda objetivo extendiendo lentamente el émbolo. Después de eliminar el iodixanol de la solución viral según se describe en el manuscrito, use una jeringa para inyectar cuidadosamente el virus en una cinta de diálisis. Para concentrar la solución viral, retire la cinta de diálisis del tampón de diálisis y colóquela en una bolsa de plástico pequeña con cierre hermético.

Luego, agregue de 15 a 25 mililitros de polietilenglicol al 40 % a la bolsa para que la caja de diálisis quede completamente sumergida.