Reprogramación de células sanguíneas humanas en células madre pluripotentes inducidas mediante el virus Sendai

Tome un cultivo de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs).

Agregue el virus Sendai que codifica los factores de transcripción de reprogramación. Cubra y selle la placa.

Centrifugar para mejorar el contacto entre el virus y la célula e incubar.

Tras la fusión del virus, el ARN viral expresa factores de transcripción que activan los genes de pluripotencia celular y reprimen los genes específicos de linaje para iniciar la reprogramación.

Durante este proceso, un subconjunto de PBMC transducidos se convierte en células madre pluripotentes inducidas (iPSC) y expresa proteínas de adhesión.

Trasládelos a un pocillo recubierto con matriz y centrifugue las células. Reemplace el sobrenadante con un medio de crecimiento.

Tras la incubación, las iPSC se adhieren a la matriz, mientras que los PBMC transducidos no adherentes permanecen en suspensión.

Transfiera la suspensión a un pocillo recubierto y centrifugue. Añada el medio al pocillo original e incube ambos.

Los PBMC transducidos restantes inician la reprogramación, se convierten en iPSC y se adhieren. Este paso maximiza la retención de células reprogramadas.

Sustituya el medio diariamente para mantener el crecimiento de las iPSC.

En este procedimiento, transfiera las células sanguíneas a un tubo cónico de 15 mililitros y cuéntelas utilizando un hemocitómetro. A continuación, prepare tres veces diez a la quinta células para la transducción y centrifugue las células a 515 × g durante cinco minutos a temperatura ambiente.

A continuación, deseche el sobrenadante por succión y resuspenda las células en 0,5 mililitros de medio para células sanguíneas. Luego, transfiera las células a un pocillo de una placa de 24 pocillos no recubierta. Derrita la mezcla del virus Sendai en hielo y añádala a las células suspendidas.

Selle la placa con una película de sellado y centrifúguela a 1.150 × g durante 30 minutos a 30 °C. Después de la centrifugación, incube las células a 37 °C en 5 % de CO₂ durante la noche. Al día siguiente, para recubrir una placa de 24 pocillos con vitronectina, diluya la solución de vitronectina en PBS para obtener una concentración final de 5 µg/mL.

A continuación, agregue un mililitro de vitronectina a un pocillo e incube a temperatura ambiente durante al menos una hora. Posteriormente, elimine la solución de recubrimiento y transfiera todo el medio que contiene las células y el virus al pocillo recubierto. Luego, recoja las células restantes con 0,5 mililitros adicionales de medio fresco para células sanguíneas y añádalos al pocillo que contiene las células.

Posteriormente, centrifugue la placa a 1.150 × g durante diez minutos a 35 °C y, luego, mantenga las células a 37 °C en 5 % de CO₂ durante la noche. Para la segunda transferencia celular, recubra el pocillo con 5 µg/ml de vitronectina según se describió previamente. Utilice un pocillo de la placa por cada transducción y transfiera la suspensión celular de la primera placa a la placa recién recubierta con vitronectina.

Mientras tanto, agregue un mililitro de medio para iPSC a un pocillo de la primera placa para mantenimiento, e incube a 37 grados Celsius en 5% de dióxido de carbono, con un cambio diario de medio con medio fresco para iPSC. Las colonias aparecerán entre los días 14 y 21 después de la transducción. Centrifugue la placa recién recubierta, que contiene las células en suspensión, a 1.150 × g a 35 grados Celsius durante diez minutos.

Después de la centrifugación, incubar las células a 37 grados Celsius en 5% de dióxido de carbono durante la noche. Al día siguiente, eliminar el sobrenadante y reemplazarlo por medio fresco para células madre pluripotentes inducidas. Mantener las células adheridas con cambios diarios de medio hasta alcanzar una confluencia del 80%.