JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiología
0 vistas • 3:41 min • August 31st, 2026
Comience con tubos que contienen células epiteliales pulmonares humanas.
Añada virus de la influenza biotinilados e incube en hielo. Los virus se unen a la superficie celular sin ser internalizados.
Centrifugar para separar las células unidas al virus, eliminar el sobrenadante y resuspender.
En el tubo del punto temporal inicial, agregue estreptavidina sin marcar, que se une a los virus biotinilados, formando complejos.
Añada estreptavidina marcada con fluoróforo, que no logra unirse al complejo de virus estreptavidina-biotina. Lave y fije las células.
Incube el tubo del punto temporal posterior a una temperatura más alta, permitiendo la internalización del virus, luego regrese al hielo.
Añada estreptavidina sin marcar y un agente que bloquea la internalización, el cual previene la absorción viral adicional, e incube. La estreptavidina se une a los virus biotinilados unidos a la superficie, luego lave.
Fije las células y agregue un tampón que contenga detergente para permeabilizarlas.
Lave y agregue estreptavidina marcada con fluoróforo, que ingresa a las células y se une a la biotina.
Analice las muestras mediante citometría de flujo.
Una mayor fluorescencia en el punto temporal posterior confirma la internalización viral exitosa.
Después de repetir el lavado una vez más, enfríe los tubos en hielo durante 10 minutos. Una vez que los tubos se hayan enfriado, centrifugue nuevamente y use 100 microlitros de virus biotinilado diluido en PBS de infección para resuspender los botones celulares tras incubar en hielo durante una hora; repita la centrifugación y lave con PBS dos veces, procesando las siguientes muestras en paralelo tanto como sea posible para las muestras de cero minutos.
Para tratar las muestras de cero minutos más STV, centrifugar los tubos, eliminar el sobrenadante y usar 15 microlitros de STV al 2% de BSA y 0,1% de azida sódica en PBS para resuspender el pellet celular. Incubar en hielo durante 30 minutos. Luego centrifugar y usar PBS para lavar las células dos veces después de la fijación con PFA como se acaba de demostrar, almacenar las muestras a cuatro grados Celsius.
Para las muestras de más de 30 minutos con STV. Después de la centrifugación, re suspenda las muestras en 200 microlitros de PBS con 2% de BSA, tras una incubación a 37 grados Celsius durante 30 minutos.
Centrifugar y resuspender las células en 50 microlitros de STV con 2% de BSA y 0,1% de azida sódica en PBS, incubar en hielo durante 30 minutos antes de lavar y fijar. Luego, después de permeabilizar y teñir todas las muestras con STV-Cy3, siguiendo los detalles del protocolo descrito en el texto, almacenar las muestras a cuatro grados Celsius. Finalmente, analizar las muestras mediante citometría de flujo.