JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiología
0 vistas • 3:00 min • August 31st, 2026
Comience con una placa de pocillos que contenga una suspensión de fagos diluida en serie en caldo rico en nutrientes como tratamiento y caldo sin fagos como control.
Agregue E. coli a cada pocillo. Utilizando un espectrofotómetro, mida la densidad óptica (DO) inicial para registrar la concentración bacteriana inicial.
A continuación, incube la placa para permitir el crecimiento bacteriano y la infección por fagos.
En el control, las bacterias utilizan los nutrientes y proliferan, aumentando la DO.
En el tratamiento, los fagos se unen a los receptores de la superficie bacteriana e inyectan sus genomas en el citoplasma.
Utilizando la maquinaria de la célula huésped, el genoma viral se replica y produce proteínas virales, que se ensamblan en nuevas partículas virales. Estas partículas lisarán la célula, liberando la descendencia.
Mida la DO a intervalos para comparar el crecimiento bacteriano.
Los pocillos de control muestran un aumento progresivo en la DO, mientras que los pocillos tratados con fagos presentan valores de DO más bajos, con reducciones mayores a concentraciones más altas de fagos.
Esto ayuda a determinar la concentración de fagos necesaria para lograr la máxima inhibición del crecimiento bacteriano.
Para comenzar, prepare el ensayo en microplaca utilizando puntas filtradas para evitar la contaminación cruzada. Primero, agregue 180 microlitros de mTSB en los pocillos de las columnas uno a 12 de la microplaca de 96 pocillos. Luego, prepare diluciones seriadas diez veces de cada fago en las columnas uno a ocho de las microplacas estériles de 96 pocillos para montar el ensayo. Añada 20 microlitros de fagos individuales o cócteles de fagos a los pocillos uno a ocho de la fila superior A de la microplaca.
Para el control sin fagos y el control en blanco, agregue 20 microlitros de mTSB al pozo superior de las columnas nueve a 12. Mientras pipetea, mezcle el contenido de los pozos mediante aspiraciones suaves y repetidas al menos cinco veces y cambie las puntas entre cada dilución. Retire 20 microlitros de la última fila H y luego prepare un reservorio para la cepa bacteriana en prueba transfiriendo dos a tres mililitros de la cultura diluida al reservorio utilizando una pipeta de un mililitro.
Utilizando una pipeta multicanal, agregue 20 microlitros de la cultura bacteriana diluida a cada pocillo en las columnas uno a 10, cambiando las puntas entre cada adición. Tape y incube la microplaca a 37 grados Celsius. A intervalos de dos horas, retire la microplaca del incubador y lea la placa utilizando un lector de microplacas.
Alternativamente, incube la placa en un lector de microplacas y léala a lo largo del tiempo.