Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 2:48 min. • August 31st, 2026
Tome un cultivo de células mamíferas en fase estacionaria con replicación mínima de ADN y recoja el medio acondicionado.
Añada el virus del herpes simple (VHS) e incube con agitación ocasional para permitir la fijación viral. Lave para eliminar el virus no unido y restablezca el medio acondicionado.
Tras la incubación, el virus se fusiona con la membrana del huésped, liberando el nucleocápside en el citoplasma.
El ADN bicatenario viral entra al núcleo, se circulariza y expresa proteínas virales para la replicación del ADN viral.
Las proteínas virales y del huésped desenrollan el ADN viral y sintetizan un cebador de ARN. A continuación, el complejo de la polimerasa del ADN viral se une y alarga el cebador para la síntesis de ADN.
A medida que avanza la replicación, agregue un análogo de nucleósido al cultivo. Este entra en las células y se convierte en forma de trifosfato.
Dado que la replicación del ADN del huésped es mínima, el análogo se incorpora preferentemente al ADN viral en replicación, marcando así los genomas virales.
Los genomas virales marcados están listos para el análisis proteómico posterior de las proteínas asociadas.
Comience este procedimiento con el cultivo de células MRC-5 según se describe en el protocolo escrito. Luego, diluya HSV-1 en solución salina fría tamponada con tris o TBS. Para los siguientes pasos, es importante apagar el ventilador y la cabina de cultivo de tejidos para evitar que las células se sequen.
Utilice una pipeta para transferir el medio de crecimiento de las células MRC-5 a un frasco estéril, para volver a añadírselo a las células después de la infección. Infecte las células añadiendo siete mililitros de virus diluido a las células. Agite suavemente las células cada 10 minutos durante una hora a temperatura ambiente.
Tras la adsorción, aspire el inóculo, lave las células con 50 mililitros de TBS a temperatura ambiente y reemplace el medio de crecimiento original. A continuación, incube las células a 37 grados Celsius en presencia de 5% de dióxido de carbono. Después del inicio de la replicación del ADN viral, alrededor de cuatro horas postinfección, marque el ADN viral en replicación.
Para ello, diluya EdC en un mililitro de medio de crecimiento y añádalo al medio de cultivo celular de las células infectadas durante dos a cuatro horas.