Aislamiento de proteínas a partir de complejos ADN viral-proteína

Tome los núcleos celulares que contienen genomas virales marcados con nucleótidos modificados con alquino.

Suspenda los núcleos en una mezcla de azida de biotina e iones de cobre, e incube.

El ion cobre facilita la unión covalente del grupo azida y el grupo alquino.

Centrifugar y desechar el sobrenadante.

ReSuspender en tampón, transferir y centrifugar para obtener el precipitado.

Congele rápidamente, luego descongele el precipitado para facilitar la lisis.

Re-suspender y sonicar para lisar los núcleos.

Centrifugue y recoja el sobrenadante que contiene complejos de proteína-ADN viral.

Filtre el sobrenadante para eliminar contaminantes.

Diluya el filtrado.

Agregue perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina e incube para facilitar la unión con los complejos proteína-ADN biotinilados.

Aplique un campo magnético para recolectar las perlas y lávelas para eliminar los contaminantes.

Repita el lavado.

Agregue un tampón de elución y caliente para separar y desnaturalizar las proteínas.

Separar las perlas, recolectar el eluato.

Congele rápidamente las proteínas aisladas. Almacénelas a temperaturas ultra bajas para análisis posteriores.

Después de eliminar completamente el PBS, re-suspenda el sedimento nuclear en 10 mililitros de mezcla de reacción click, pipeteando suavemente de arriba abajo cinco veces con una pipeta de 10 mililitros. Incube la muestra en rotación durante una hora a cuatro grados Celsius, antes de sedimentar los núcleos como antes.

Elimine completamente la mezcla de la reacción click, luego lave el precipitado re-suspendiéndolo suavemente en 10 mililitros de PBS y centrifugando nuevamente. Ahora, re-suspenda cuidadosamente el precipitado nuclear en un mililitro de PBS y transfiera la solución a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Tras la centrifugación, elimine completamente el PBS y congele rápidamente el precipitado en nitrógeno líquido.

En este momento, el precipitado puede almacenarse a 80 grados Celsius o puede continuarse con el procedimiento. Para lisar los núcleos y fragmentar el ADN, re-suspender los núcleos descongelados en 500 microlitros de tampón B1 pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Incubar la suspensión en hielo durante 45 minutos.

A continuación, sonicar las muestras seis veces durante 30 segundos cada una al 40% de amplitud, utilizando una sonda con punta microscópica de tres milímetros. Coloque las muestras en hielo durante al menos 30 segundos entre cada impulso. Después de la sonicación, las muestras deben verse claras, no turbias.

Centrifugar a 14.000 x G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para obtener un pellet de los restos celulares. El tamaño del pellet debería disminuir considerablemente; filtrar el sobrenadante a través de un filtro celular de 100 micrones y conservar el flujo filtrado. A continuación, añadir 500 microlitros de tampón B2 al sobrenadante filtrado.

Para unir el ADN biotinilado a las perlas recubiertas de estreptavidina, prepare las perlas magnéticas de estreptavidina transfiriendo 300 microlitros de suspensión de perlas a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Prepare un tubo de perlas por cada muestra. Lave las perlas tres veces con un mililitro de tampón B2 agitando mediante vortex para re-suspenderlas, colocándolas en un imán para separar las perlas y aspirando el tampón de lavado.

Luego, agregue 900 microlitros de la muestra a las perlas lavadas. El resto de la muestra se utilizará para el aislamiento de ADN de entrada y proteínas. Incube la suspensión durante la noche a cuatro grados Celsius con rotación.

Al día siguiente, coloque las muestras en un portamatrices magnético para microtubos y retire el sobrenadante. Re-suspenda suavemente las perlas en un mililitro de tampón B2, y luego incube con rotación a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Vuelva a retirar el sobrenadante utilizando el portamatrices magnético para microtubos.

Esta vez, re-suspenda suavemente las perlas en un mililitro de tampón B3 y rote a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Después de eliminar el sobrenadante de la mezcla de perlas utilizando el imán, re-suspenda las perlas en 50 microlitros de tampón de muestra 2x Laemmli para eluir los complejos de ADN-proteína. A continuación, hierva las muestras a 95 grados Celsius durante 15 minutos.

Vortex una mezcla antes de centrifugar rápidamente las muestras en una microcentrífuga. Aplique las muestras al imán y transfiera el eluato a un tubo nuevo. Finalmente, congele rápidamente las muestras y almacénelas a 80 grados celsius.

Realice el análisis de proteínas según se describe en el protocolo del texto.