Un dispositivo recubierto de silicona impreso en 3D para modelar la infección del tracto urinario asociada al catéter

Tome una placa de pocillos múltiples que contenga orina humana estéril.

Inocular los pocillos de prueba con bacterias. Los pocillos de control contienen orina sola.

Tome un dispositivo impreso en 3D y recubierto de silicona que imita la superficie interna de un catéter, donde se desarrollan biopelículas durante las infecciones urinarias asociadas al catéter.

Colóquelo en los pocillos, selle la placa e incube.

Las bacterias se adhieren a la superficie del dispositivo, utilizan los nutrientes de la orina y forman biopelículas.

Enjuague el dispositivo con un tampón para eliminar las bacterias sueltas.

Coloque el dispositivo en una placa de pocillos múltiples que contenga cristal violeta, que interactúa con la biopelícula para teñirlo.

Enjuague con agua y séquelo.

Sumerja el dispositivo en una placa de pocillos múltiples que contenga una solución ácida para interrumpir las interacciones colorante-biopelícula y liberar el tinte en la solución.

Mida la absorbancia de las soluciones en cada pocillo utilizando un espectrofotómetro.

Una mayor absorbancia en los pocillos de prueba en comparación con los pocillos de control confirma la formación de biopelículas en el dispositivo, lo que indica su idoneidad para modelar la infección del tracto urinario asociada al catéter.

Para comenzar, obtenga una muestra de orina humana agrupada. Alícuota 135 microlitros de orina humana acumulada en cada pocillo de prueba de una placa de 96 pocillos siguiendo el diseño designado.

Inocular cada pocillo en la prueba con 15 microlitros de cultivo bacteriano normalizado durante la noche para lograr un volumen final de 150 microlitros por pocillo. Reserve al menos 100 microlitros de este cultivo para los siguientes pasos de validación de dilución en serie.

Prepare pocillos de control negativo agregando 150 microlitros de orina humana estéril acumulada en pozos designados.

Ahora, inserte las clavijas en sus pozos correspondientes. Presione hacia abajo la tapa de la clavija hasta que quede al ras de la placa y asegúrela con la tapa de la microplaca, pegándola con cinta adhesiva si es necesario.

Luego, coloque los modelos de clavijas en una tina o bolsa de plástico sellada que contenga un rollo azul húmedo para evitar la evaporación. Incubar estáticamente durante 24 horas a 37 grados centígrados.

Para la validación del inóculo, alícuotas 180 microlitros de PBS en las filas 2 a 6 de la primera columna de una placa de 96 pocillos antes de agregar el cultivo reservado.

Ahora, transfiera 20 microlitros del primer pocillo al segundo pocillo, mezclando suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Continúe las diluciones en serie hasta que el inóculo inicial se haya diluido en el pozo final.

Luego, coloque 10 puntos de microlitros de cada dilución en medios sólidos apropiados por triplicado. Después de la incubación nocturna a 37 grados centígrados, cuente las colonias de cada lugar.

Para la cuantificación de biopelículas, retire el modelo de clavija de la microplaca e inviértalo bajo una llama o dentro de un gabinete de seguridad microbiológica, con las clavijas hacia arriba. Deseche las microplacas usadas.

Transfiera la tapa de la clavija a una microplaca nueva que contenga alícuotas de 180 microlitros de PBS estéril para enjuagar las células no adheridas.

A continuación, trabajando asépticamente, coloque una rejilla de tubos de ensayo de vidrio estéril en el banco y coloque la parte superior de la rejilla ajustada que sostiene la tapa de la clavija.

Con una micropipeta, alícuota 600 microlitros de PBS estéril en cada tubo de ensayo. Ahora, inserte la tapa de la clavija en el estante, asegurándose de que las clavijas estén alineadas con los tubos de ensayo. Retire la cinta de autoclave de la tapa.

Use pinzas estériles para empujar cada clavija a través de la tapa hacia los tubos de ensayo directamente debajo. Luego, vuelva a colocar las tapas de los tubos de ensayo y agite cada tubo durante 60 segundos para desalojar las células asociadas a la biopelícula.

Retire 100 microlitros de cada tubo de vórtice y realice diluciones en serie en PBS estéril como se hizo anteriormente.

Para teñir las células con violeta cristalina, pipetee 180 microlitros de violeta cristalina al 0,1 por ciento en peso por volumen en agua destilada estéril en los 24 pocillos de prueba de una placa de 96 pocillos. Inserte el modelo de clavija enjuagado en los pocillos correspondientes e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos.

Después de teñir, retire el modelo de clavija de la placa y deseche la placa usada. En una tina limpia, enjuague todo el modelo de clavija con agua corriente del grifo con agitación suave.

Después de 2 lavados más, invierte el modelo de clavija y déjalo secar completamente a temperatura ambiente. Luego agregue 180 microlitros de ácido acético al 30% a una nueva placa de 96 pocillos. Inserte el modelo de clavija seca en los pocillos correspondientes.

Cuando se complete la incubación, retire el modelo de clavija de la microplaca. Mida la densidad óptica de los pocillos teñidos a 540 nanómetros utilizando un lector de microplacas o un espectrofotómetro.