Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 4:35 min. • August 31st, 2026
Comience con células de mamífero infectadas con un adenovirus.
Realice ciclos repetidos de congelación y descongelación para lisar las células y liberar los viriones.
Centrifugar el lisado para sedimentar los residuos. Recoger el sobrenadante que contiene las partículas virales.
Coloque el sobrenadante viral sobre un gradiente escalonado de cloruro de cesio para la separación basada en densidad.
Ultracentrifugar para permitir que las partículas virales migren de acuerdo con sus densidades de flotación.
Los viriones intactos que contienen el genoma adenoviral completo son más densos debido al ADN empaquetado y se sedimentan en una banda inferior, mientras que las cápsidas vacías más ligeras y los restos permanecen en las capas superiores.
Retire las capas superiores. Recopile la banda inferior de viriones que contienen el genoma.
Re-suspender los viriones en cloruro de cesio de densidad uniforme y ultracentrifugar nuevamente para refinar la separación y concentrar las partículas completas.
Deseche las capas superiores y recupere la banda inferior.
Dialice la muestra para eliminar el cloruro de cesio.
Los vectores adenovirales de alta pureza que contienen el genoma ya están listos para aplicaciones posteriores.
Para preparar el lisado viral para la purificación mediante gradiente de cloruro de cesio, congele/descongele la suspensión de células y virus cuatro veces. Luego, centrifugue el lisado viral a 500 veces g durante ocho minutos a temperatura ambiente.
Luego, recolecte el sobrenadante que contiene el adenovirus de alta capacidad. Pipetee cuidadosa y lentamente soluciones de cloruro de cesio en los tubos en el siguiente orden: 0,5 mililitros de solución de 1,5 gramos por centímetro cúbico, tres mililitros de solución de 1,35 gramos por centímetro cúbico y 3,5 mililitros de solución de 1,25 gramos por centímetro cúbico. Añada encima aproximadamente 4,5 mililitros del sobrenadante del vector clarificado sobre la capa de 1,25 gramos por centímetro cúbico.
Centrifugar las gradientes en una ultracentrífuga utilizando un rotor de oscilación a 12 grados Celsius durante al menos dos horas a 226.000 × g para separar las partículas virales que contienen el genoma del adenovirus de alta capacidad de las partículas vacías y los restos celulares. Tras la centrifugación, se forma una banda difusa de restos celulares en la parte superior de los tubos. Debajo de esta, pueden observarse dos bandas blancas.
La banda superior contiene partículas vacías, mientras que la banda inferior es el adenovirus de alta capacidad. Retire cuidadosamente las capas de restos celulares y partículas vacías. Luego, recoja un mililitro de las bandas inferiores de cada tubo.
Transfiera el virus a un tubo estéril de 50 mililitros. Agregue hasta 24 mililitros de solución de cloruro de cesio a 1.35 gramos por centímetro cúbico a las partículas virales recolectadas y mezcle cuidadosamente. Llene los tubos de centrífuga hasta el borde con la solución viral de cloruro de cesio a 1.35 gramos por centímetro cúbico.
Luego, centrifugar durante toda la noche a 226.000 ×g a 12 grados Celsius en un ultracentrífugo utilizando un rotor de balanceo con aceleración y desaceleración lentas. Retirar las capas superiores desde la parte superior usando una pipeta. A continuación, recoger el adenovirus de alta capacidad presente en la banda inferior más prominente utilizando una punta de pipeta nueva.
Finalmente, realice una diálisis de las partículas virales recolectadas para el intercambio de tampón. Luego, determine la titulación de la preparación final según las instrucciones detalladas en el protocolo escrito.