Confirmación de la transducción viral en hígado de rata recelularizado mediante tinción inmunohistoquímica

Comience con tejido de hígado de rata recelularizado congelado, que contiene hepatocitos humanos, embebido en medio crioprotector.

En este tejido, los hepatocitos transducidos expresan la proteína fluorescente verde esmeralda (EmGFP), una proteína reportera codificada por el vector viral.

Use un criotomo para cortar secciones delgadas que conserven la arquitectura celular y tisular. Transfiera las secciones a un portaobjetos.

Trate las secciones con un detergente suave para permeabilizar la membrana celular.

Aplique un anticuerpo primario anti-EmGFP que se una específicamente a la proteína reportera fluorescente expresada en las células transducidas.

Lave para eliminar los anticuerpos no unidos.

Introduzca un anticuerpo secundario conjugado con un fluoróforo rojo, que se une al anticuerpo primario, y luego lave.

Añada un colorante fluorescente azul específico para ADN que se una al ADN celular.

Bajo un microscopio de fluorescencia, la colocalización de la fluorescencia roja con los núcleos teñidos en azul confirma que los hepatocitos transducidos en el tejido hepático expresan con éxito la proteína reportera viral.

Usando un escalpelo, corte muestras de cada lóbulo hepático con un grosor de aproximadamente medio centímetro y una longitud de 1,5 a 2 centímetros. Incube los cortes en paraformaldehído al 4 % con sacarosa al 4 % durante 90 minutos a cuatro grados Celsius.

Luego, lave las muestras tres veces con PBS durante un minuto por lavado. Después de los lavados, incube las muestras durante la noche en sacarosa al 8 % a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, cargue las muestras en moldes criogénicos que contengan algo de medio de fijación.

Evite introducir burbujas de aire. Una vez cargadas, cubra completamente las muestras con medio de fijación y colóquelas a menos 80 grados Celsius. Una vez congeladas, prepare secciones criogénicas de 10 micrones a partir de las muestras utilizando un criotomo.

Tiña las muestras según sea necesario para confirmar la recelularización.