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Microbiología
0 vistas • 3:33 min • August 31st, 2026
Tome una cultura de células humanas.
Añada lentivirus que codifican un shRNA dirigido al ARNm del huésped bajo un promotor sensible a la tetraciclina fusionado a un operador, de manera condicional.
El lentivirus también lleva genes para un represor de tetraciclina y una proteína de resistencia a antibióticos, colocados bajo un promotor constitutivo.
Incubar para permitir la entrega de ARN viral a las células huésped.
El ARN se convierte en ADNc e integra en el genoma del huésped.
Lave, agregue medio e incube para permitir la expresión del represor de tetraciclina y la proteína de resistencia al antibiótico, generando células transducidas. El represor de tetraciclina se une al operador y suprime la expresión de ARNih.
Lave, agregue medio suplementado con antibiótico e incube.
Las células transducidas expresan la proteína de resistencia al antibiótico, lo que permite su supervivencia selectiva en presencia del antibiótico.
Agregue doxiciclina, un análogo de la tetraciclina, al cultivo.
La doxiciclina se une al represor de tetraciclina, impidiendo su unión al operador y permitiendo la expresión del ARNip.
El ARNip se procesa en ARNip, que se incorpora al complejo RISC y degrada el ARNm diana.
Esto genera células con silenciamiento condicional dependiente de doxiciclina.
Para generar líneas celulares estables, comience sembrando células de cáncer de colon HCT-116 y células de cáncer de mama MDA-MB-231 en una placa de 12 pocillos con 50.000 células por pocillo.
Incubar a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Cuando las células alcancen una confluencia del 60-70%, lavar las células con PBS y añadir un mililitro de medio que contenga virus a cada pocillo. Al día siguiente, retirar cuidadosamente el medio que contiene el virus mediante aspiración.
Luego de lavar las células con PBS, agregue medio que contenga FBS libre de tetraciclina. Después de 72 horas, lave las células como antes y agregue medio suplementado con un microgramo por mililitro de puromicina para la selección de células transducidas con virus. Seleccione las células transducidas con virus cultivándolas en presencia de puromicina durante tres a 14 días.
Observe la muerte parcial de las células por puromicina en los pocillos con células transducidas con virus. Las células no transducidas no crecerán en presencia de puromicina.
Verifique la eficiencia del silenciamiento condicional en las células de cáncer de colon HCT-116 y de cáncer de mama MDA-MB-231 resistentes a la puromicina mediante la adición de medio con diferentes concentraciones de doxiciclina y el cultivo de las células durante 72 horas.