JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiología
0 vistas • 3:51 min • August 31st, 2026
Tome vectores lentivirales que contienen el antígeno p24 del VIH-1, un marcador proteico utilizado para la detección.
Agregue un detergente para lisar y liberar p24, luego diluya la muestra en forma seriada.
Tome una microplaca recubierta con anticuerpos monoclonales anti-p24 y un agente bloqueante para prevenir la unión no específica.
Agregue las diluciones de la muestra y los estándares de p24 como referencias.
Incubar para permitir la interacción del p24 con los anticuerpos a través de un epítopo específico, luego eliminar los componentes no unidos.
Incubar con anticuerpos policlonales anti-p24 que se unen a diferentes epítopos en p24. Eliminar cualquier anticuerpo no unido.
Añada anticuerpos marcados con peroxidasa que se unan a los anticuerpos policlonales. Elimine los anticuerpos no unidos.
Añada un sustrato de peroxidasa que se convierta en un producto coloreado.
Agregue un ácido para inactivar la peroxidasa y estabilizar el producto.
Mida la absorbencia correspondiente a la intensidad del color, que es proporcional a la concentración de p24.
Genere la gráfica estándar y estime las concentraciones de las muestras para determinar la titulación viral.
Recubra una placa de 96 pozos de unión elevada con 100 microlitros de anticuerpo monoclonal anti-p24 a una dilución de 1:1.500 según el programa de vacunas contra el VIH del NIH para el kit de ensayo de captura de antígeno p24 del VIH-1. Incube la placa durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, lave la placa tres veces con 200 microlitros de TWEEN-20 al 0,05 % en PBS frío.
Para evitar la unión no específica, bloquee la placa con 200 microlitros de albúmina sérica bovina al 1 % durante una hora a temperatura ambiente. Luego, lave la placa con 200 microlitros de TWEEN-20 al 0,05 % en PBS frío tres veces. A continuación, prepare las muestras de vectores concentrados y no concentrados a una concentración final del 10 % diluyendo el vector con agua doblemente destilada y Triton X-100.
A continuación, prepare los estándares de VIH-1 mediante diluciones seriadas de dos veces, comenzando en cinco nanogramos por mililitro. Después de diluir las muestras de vector concentradas y no concentradas, pipetee las muestras en la placa por triplicado e incube a cuatro grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, lave la placa, luego agregue 100 microlitros de anticuerpo de conejo policlonal anti-p24 en cada pocillo e incube a 37 grados Celsius durante cuatro horas.
Después de seis lavados, incubar la placa con anticuerpo secundario de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa a 37 grados Celsius durante una hora. Después de varios lavados, incubar la placa con sustrato de peroxidasa TMB a temperatura ambiente durante 15 minutos. Añadir ácido clorhídrico 1 N para detener la reacción. Y leer la absorbancia a 450 nanómetros con un lector de placas de absorbancia.