Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 2:44 min. • August 31st, 2026
Comience con una mezcla de plásmidos suspendidos en un medio nutriente.
El primer plásmido porta un genoma viral adenoasociado recombinante (AAV) que codifica el gen de interés.
El segundo plásmido codifica las proteínas Rep y Cap.
El tercer plásmido codifica proteínas auxiliares.
Agregue un agente de transfección a la solución de plásmido. Mezcle bien e incube.
El agente de transfección con carga positiva se une al ADN plasmídico con carga negativa, formando complejos.
Introduzca los complejos en una monocapa de células de mamífero. Incube.
Los complejos ingresan a las células mediante endocitosis.
En el interior de las células, los genes codificados por el plásmido inducen la expresión de proteínas virales.
La proteína Rep replica el genoma viral, mientras que las proteínas Cap forman las cápsides.
La proteína Rep, junto con las proteínas auxiliares, empaqueta el genoma viral replicado en los cápsides, formando partículas completas de AAV.
Los vectores virales adenoasociados recombinantes que portan el gen de interés están listos para aplicaciones de entrega génica.
Después de generar los constructos rAAV9 y cultivar las células HEK293 según el protocolo descrito, para transfectar las células en el día uno, combine 70 microgramos del plásmido AAV Rep-Cap, 70 microgramos del plásmido rAAV9 y 200 microgramos del plásmido auxiliar Ad en un tubo centrífugo de 50 mililitros. Añada 49 mililitros de DMEM a temperatura ambiente sin FBS al tubo y mezcle bien. Luego, para obtener una relación de cuatro a uno de PEI respecto al ADN, añada 1.360 microlitros de PEI al tubo y mezcle bien.
Incube la solución a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos. Después de la incubación, agregue cinco mililitros de la solución a cada placa de 150 mililitros de células. Cultive las células a 37 grados Celsius y 5 %CO2 durante 50 a 72 horas.