Purificación de partículas virales recombinantes a partir de células renales humanas transfectadas

Comience con un lisado celular que contenga ADN celular agregado con proteínas celulares y partículas virales.

Agregue iones de magnesio, seguidos de una nucleasa, para activar la degradación enzimática del ADN celular y romper los agregados de ADN-proteína.

Centrifugar para separar los residuos y recoger el sobrenadante que contiene partículas virales.

Coloque el sobrenadante sobre un gradiente discontinuo de iodixanol con concentraciones crecientes de arriba hacia abajo, luego llene el tubo con tampón.

Ultracentrífuga para separar los componentes según su densidad. Las partículas virales se acumulan en la interfase entre las capas de alta y media densidad.

Inserte una aguja en esta interfase y recoja las partículas virales en un tubo.

Añada un tampón que contenga componentes estabilizantes, los cuales previenen la agregación de partículas virales.

Luego transfiera la solución a un tubo con un filtro de membrana.

Centrifugue para concentrar las partículas virales por encima del filtro.

Agregue el tampón suplementado con el agente estabilizante y centrifugue nuevamente para obtener partículas virales purificadas.

Para recolectar las células transfectadas, desprenda y suspenda las células utilizando el medio de cultivo para pipetear hacia arriba y hacia abajo. Luego transfiera las suspensiones celulares a tubos estériles de 50 mililitros. Centrifugue las células a 500 ×g durante cinco minutos.

Luego, agregue cinco mililitros de PBS a cada tubo y resuspenda los botones celulares antes de combinar todas las suspensiones en un tubo de 50 mililitros. Después de centrifugar las células a 500 veces g durante cinco minutos, deseche el sobrenadante. Para purificar el AAV, resuspenda el botón en 10 mililitros de tampón de lisis.

Congele el lisado a menos 80 grados Celsius o en un baño de hielo seco–etanol. Luego, déselo a 37 grados Celsius. Vortexee el lisado durante un minuto antes de repetir las etapas de congelación y descongelación otras dos veces.

A continuación, agregue cloruro de magnesio de un milimolar al lisado descongelado. Luego agregue nucleasa hasta una concentración final de 250 unidades por mililitro. Incube la solución a 37 grados Celsius durante 15 minutos para disolver la agregación de proteína ADN.

Centrifugar la muestra a 4.800 veces g y cuatro grados Celsius durante 20 minutos. Luego recoger el sobrenadante. Mientras tanto, para preparar una solución de gradiente de yodixanol al 17 %, mezclar cinco mililitros de PBS 10X con 0,05 mililitros de cloruro de magnesio uno molar, 0,125 mililitros de cloruro de potasio uno molar, 12,5 mililitros de medio de gradiente de densidad y 10 mililitros de cloruro de sodio cinco molar.

Use agua para ajustar el volumen total a 50 mililitros. Después de preparar las soluciones en gradiente al 25%, 40% y 60% según el protocolo descrito en el texto, use una aguja y una jeringa para cargar cinco mililitros de la solución en gradiente al 17% en un tubo de polipropileno. A continuación, añada cinco mililitros de cada una de las soluciones en gradiente al 25%, 40% y 60%.

Coloque el lisado encima del gradiente. Luego llene el tubo con tampón de lisis y cúbralo con un tapón. Centrifugue el gradiente a 185.000 × g y 16 °C durante 90 minutos.

Después de la centrifugación, use una jeringa para recolectar la fracción vírica al 40% insertando una aguja de calibre 21 en la intersección entre las fracciones al 40 y al 60%, evitando completamente la capa al 25%. Mezcle la fracción vírica con solución estéril de PBS de copolímero en bloque de polioxietileno polioxipropileno, o PEG-PPG, hasta un volumen total de 15 mililitros. Cargue la mezcla en un tubo de filtro con un límite de peso molecular de 100 kilodalton.

Luego, centrifugue la muestra a 2,000 veces g y cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Decante la solución desde la parte inferior del tubo. A continuación, use PEG-PPG para rellenar el tubo del filtro hasta 15 mililitros.

Centrifugar el tubo a 2,000 veces g y cuatro grados Celsius durante 20 minutos. Después de repetir el rellenado y la centrifugación dos veces más, recoger la fracción purificada del virus rAAV9 que aún se encuentra por encima del filtro.