Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 3:07 min. • August 31st, 2026
Tome un medio que contenga partículas retrovirales que codifiquen oncogenes virales y un gen de resistencia a antibióticos.
Centrifugue el medio para eliminar los restos celulares.
Recolecte el sobrenadante que contiene las partículas virales y colóquelo sobre un cultivo de células endoteliales.
Incubar para permitir la entrada viral.
El ARN viral se transcribe inversamente en ADN, el cual se integra en el genoma del huésped.
El gen de resistencia a antibióticos produce una proteína de resistencia. Los oncogenes producen proteínas que se unen a proteínas supresoras de tumores que controlan la división celular e inactivan dichas proteínas, extendiendo así la longevidad celular.
Sustituya el medio por un medio fresco.
Incubar nuevamente para asegurar la integración estable del ADN viral.
Retire el medio y lave las células.
Agregue una solución enzimática de disociación para desprender las células.
Transfiera la suspensión celular, centrifugue y elimine el sobrenadante.
Re-suspenda el precipitado y transfiéralo a un matraz.
Agregue un antibiótico al medio.
Solo sobreviven las células que expresan la proteína de resistencia al antibiótico, seleccionando así las células inmortalizadas por las proteínas oncogénicas virales.
Tras una incubación nocturna, recolecte el medio de la cultura celular PA317 y clarifíquelo mediante centrifugación a 300 × g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Reemplace el medio EGM de la cultura de células endoteliales al 50 % de confluencia con 12 mililitros del medio PA317 clarificado. Incube las células durante cuatro horas.
Luego, reemplace seis mililitros del medio PA317 con seis mililitros de medio EGM fresco e incube las células durante la noche. Posteriormente, retire el medio del cultivo de células endoteliales y alimente las células con 12 mililitros de medio EGM fresco. Continúe incubando las células durante 48 horas adicionales.
Para subcultivar las células endoteliales, retire el medio y lave las células con 12 mililitros de PBS sin cationes. A continuación, agregue tres mililitros de una solución disociadora enzimática comercial e incube las células a 37 grados Celsius durante tres minutos. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue las células a 300 × g durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Una vez sedimentadas, resuspenda las células en medio EGM fresco y divida la suspensión equitativamente en tres matraces T75. Ajuste el volumen de los cultivos a 12 mililitros de EGM por matraz. Luego agregue 200 microgramos por mililitro de G418 para seleccionar las células endoteliales transducidas.