Determinación de la distribución del ARN viral en células huéspedes mediante hibridación in situ fluorescente

Comience con un portaobjetos que contenga células huésped infectadas con el virus y permeabilizadas, donde los ARN virales se distribuyen entre los compartimentos nuclear y citoplasmático.

Añada un tampón de prehibridación e incube en condiciones húmedas.

En el tampón, los agentes de bloqueo bloquean los sitios de unión no específicos, mientras que los inhibidores de RNasas inactivan las RNasas y preservan la integridad del ARN.

Elimine el tampón y agregue sondas de oligonucleótidos marcadas con digoxigenina, desnaturalizadas, complementarias al ARN viral.

Incube en la oscuridad para permitir la hibridación de la sonda con el ARN, luego lave repetidamente.

Agregue un fijador para estabilizar los híbridos de sonda-ARN, luego lave repetidamente. Añada un tampón suplementado con detergente para mantener la permeabilidad celular.

Agregue un anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con un fluoróforo verde que interaccione con la digoxigenina, luego lave repetidamente.

Fije las células para preservar los complejos, luego lávelas nuevamente.

Agregue un colorante que se una al ADN para teñir los núcleos. Lave repetidamente el exceso de colorante.

Montar con un cubreobjetos y sellarlo.

Bajo un microscopio confocal, visualice la fluorescencia verde, que refleja la distribución del ARN viral entre el núcleo y el citoplasma de la célula huésped.

Después de tres lavados con PBS como se demostró, fije nuevamente las muestras en formaldehído al 4% en PBS durante 10-15 minutos antes de una segunda permeabilización como se indicó. Luego, cubra el portaobjetos con papel de aluminio para preservar la señal fluorescente y evitar el fotodesvanecimiento.

Lave las células con citrato de sodio salino 2x antes de aplicar 45 microlitros de solución de hibridación. Después de una hora a 37 grados Celsius en una cámara humidificada, agregue agua destilada a los oligonucleótidos antisentido de interés para llevar el volumen de desnaturalización a 10 microlitros. Desnaturalice los oligonucleótidos a 95 grados Celsius durante cinco minutos, antes de agregar 35 microlitros de solución de hibridación fresca por portaobjetos.

Luego, incubar las muestras de 10 a 24 horas en la cámara humidificada a 37 grados Celsius, protegidas con papel de aluminio. Al día siguiente, lavar las células con dos lavados de 10 minutos cada uno con citrato de sodio salino 2X a temperatura ambiente, seguidos de un lavado con citrato de sodio salino 1X durante 10 minutos a 25 grados Celsius.

Después del último lavado, fije las células con formaldehído al 4 % previamente enfriado en PBS durante 10-15 minutos en hielo, seguido de tres lavados con PBS fresco. A continuación, permeabilice las muestras como se muestra, seguido de la incubación con anti-digoxigenina-FITC y BSA al 0,1 % previamente enfriado en PBS, durante una hora a cuatro grados Celsius. Al final de la incubación, lave las laminillas tres veces con PBS fresco y fije las muestras con paraformaldehído al 4 % previamente enfriado en PBS durante 10-15 minutos a cuatro grados Celsius.

Después de tres lavados en PBS, marque los núcleos con 0,4 microgramos por mililitro de DAPI y 0,5 %Triton-X preenfriado en PBS durante 15 minutos en hielo, seguido de tres lavados finales en PBS. Monte los portaobjetos con perlas fluorescentes, según sea relevante para el experimento y en medio de montaje adecuado. Después de eliminar el exceso de medio de montaje con toallitas estériles, selle un cubreobjetos a cada portaobjetos con varias capas de esmalte transparente y utilice un microscopio de fluorescencia para confirmar la ejecución exitosa del experimento.

Luego se pueden obtener imágenes en un microscopio confocal para recolectar imágenes de las muestras entre una hora y una semana después del montaje, con un aumento de 630 veces.