Determinación de la distribución del ARN viral en células huéspedes mediante hibridación in situ fluorescente

Comience con un portaobjetos que contenga células huésped infectadas con el virus y permeabilizadas, donde los ARN virales se distribuyen entre los compartimentos nuclear y citoplasmático.

Añada un tampón de prehibridación e incube en condiciones húmedas.

En el tampón, los agentes de bloqueo bloquean los sitios de unión no específicos, mientras que los inhibidores de RNasas inactivan las RNasas y preservan la integridad del ARN.

Elimine el tampón y agregue sondas de oligonucleótidos marcadas con digoxigenina, desnaturalizadas, complementarias al ARN viral.

Incube en la oscuridad para permitir la hibridación de la sonda con el ARN, luego lave repetidamente.

Agregue un fijador para estabilizar los híbridos de sonda-ARN, luego lave repetidamente. Añada un tampón suplementado con detergente para mantener la permeabilidad celular.

Agregue un anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con un fluoróforo verde que interaccione con la digoxigenina, luego lave repetidamente.

Fije las células para preservar los complejos, luego lávelas nuevamente.

Agregue un colorante que se una al ADN para teñir los núcleos. Lave repetidamente el exceso de colorante.

Montar con un cubreobjetos y sellarlo.

Bajo un microsco