Purificación de vectores de virus adenoasociados mediante cromatografía de afinidad

Comience con un lisado celular filtrado que contenga vectores de virus adeno-asociado (AAV) y contaminantes derivados del hospedador.

Pase el lisado a través de una columna de afinidad basada en heparina.

Las proteínas de la cápside viral se unen electrostáticamente a los grupos de heparina con carga negativa.

Lave la columna con un tampón para eliminar los contaminantes no unidos.

Aplique un tampón que contenga detergente para solubilizar los restos membranosos.

Lave nuevamente con el tampón sin detergente.

Introduzca un tampón suplementado con cationes para crear un entorno iónico, luego lave con un tampón de salinidad moderada para liberar impurezas débilmente unidas.

Agregue un tampón de alta salinidad para interrumpir las interacciones entre la cápside y la heparina y eluir las partículas virales.

Recolecte las fracciones de elución enriquecidas en partículas virales intactas y transfiéralas a tubos concentradores centrífugos equipados con membranas de filtro.

Centrifugue los tubos para eliminar el exceso de tampón, luego recoja las fracciones virales concentradas en un tubo.

Lave la membrana con el tampón para recuperar las partículas virales residuales y maximizar el rendimiento.

Deshielo del lisado crudo a cuatro grados Celsius durante la noche.

Una vez descongelado, filtre utilizando un filtro de 0,22 micrones. Inmediatamente antes de los pasos de purificación, pase el concentrador centrífugo agregando cuatro mililitros de tampón de pretratamiento para filtro por cada columna de heparina-Sepharosa que se vaya a utilizar. Coloque el tubo en una bomba peristáltica.

Realice secuencialmente las soluciones y los medios. Prepárese para la cromatografía conectando una columna de heparina-Sepharosa de cinco mililitros al tubo y pasando 25 mililitros de DMEM Bazell a través de la columna. Luego, cargue 0,2 micromolar del lisado crudo filtrado en la columna a una velocidad de flujo de una a dos gotas por segundo.

Lave la columna secuencialmente para eluir cinco mililitros cinco veces con HBSS de cloruro de sodio 300 milimolar, con magnesio y calcio, y etiquete las cinco eluciones como E1 a E5. Cuando esté listo, centrifugue el concentrador centrífugo que contiene el tampón de pretratamiento a 900 × g durante dos minutos. Deseche el flujo atravesado. Lave el filtro del concentrador centrífugo con cuatro mililitros de HBSS con magnesio y calcio centrifugando a 1000 × g durante dos minutos.

Luego, agregue la elución E2 al concentrador centrífugo y centrifugue a 1000 × g durante cinco minutos. Deseche el flujo atravesante. De manera similar, centrifugue la elución E3 en el concentrador centrífugo hasta que el virus concentrado sea aproximadamente un mililitro.

Retire el virus concentrado del concentrador centrífugo utilizando una punta filtrada P200 y recójalo en un tubo centrífugo estéril de 1,5 mililitros. Después de recoger el virus, enjuague el concentrador centrífugo con 200 microlitros de HBSS con magnesio y calcio. Pipetee hacia arriba y hacia abajo vigorosamente durante 30 segundos para desalojar cualquier virus adherido a la membrana y recoja el virus concentrado en el mismo tubo centrífugo de 1,5 mililitros.

Mezcle bien el tubo.