JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiología
0 vistas • 3:45 min • August 31st, 2026
Comience con una suspensión de células bacterianas que expresan integrasa viral con etiqueta polihistidina.
Sonicar la suspensión para romper las membranas bacterianas y liberar la integrasa.
Transfiera el lisado a un tubo para ultracentrífuga.
Centrifugar a alta velocidad para obtener el sedimento de los restos celulares y recoger el sobrenadante.
A continuación, tome una columna de cromatografía empaquetada con resina cargada con níquel y equilibre la columna con tampón.
Cargue el lisado clarificado en la columna.
Las proteínas con histidinas se unen débilmente al níquel, mientras que la integrasa con etiqueta de polihistidina se une fuertemente.
Lave con tampón para eliminar las proteínas no unidas, luego agregue tampón de elución con una concentración de imidazol creciente linealmente.
La imidazol compite con la histidina por la unión al níquel y libera la integrasa.
Recoja las fracciones y transfiera alícuotas a tubos que contengan tampón de carga.
Caliente para desnaturalizar las proteínas, luego cargue en un gel de poliacrilamida.
Realice electroforesis y analice las bandas proteicas.
Identifique las fracciones que contienen integrasa pura, sin proteínas contaminantes, y combínelas para obtener integrasa viral purificada.
Comience descongelando un pellet de E. coli que expresa la integrasa del virus espumoso prototípico sobre hielo. Utilice un sonicador equipado con una biopunta de 0,5 pulgadas de diámetro y una microsonda cónica de 0,125 pulgadas de diámetro para sonicar durante 30 segundos al 30 % de amplitud con el tubo sobre hielo. Después de la sonicación, transfiera la muestra celular a un tubo de ultracentrífuga frío y centrifugue a 120.000 × g durante 60 minutos a cuatro grados Celsius.
Tras la centrifugación, debería haber un precipitado evidente, y el sobrenadante podría tener un color amarillo. Transfiera el sobrenadante a un tubo cónico frío de 50 mililitros. A continuación, prepare la columna de FPLC de 110 milímetros de largo y 5 milímetros de diámetro con 1,5 mililitros de resina cargada con níquel.
Primero, conecte la columna al instrumento de FPLC y aplique el tampón. El instrumento debe estar recopilando datos en tiempo real de conductividad y absorbancia UV a 280 nanómetros. Las lecturas de conductividad y UV deben estabilizarse.
Si es necesario, continúe pasando los tampones a través de la columna hasta que las lecturas sean estables. Utilizando un superloop, cargue la muestra de proteína en la columna a una velocidad de flujo de 0,15 mililitros por minuto con un límite máximo de presión de 0,5 megapascal. Conecte el superloop al FPLC AKTA.
Después de lavar la columna y eluir las proteínas, tome alícuotas de 15 microlitros del flujo inicial, del lavado y de las fracciones con pico de absorbancia a 280 nanómetros, y agregue 15 microlitros de tampón de muestra 2X para SDS-PAGE a cada muestra. Hierva las muestras durante tres minutos. Cargue 10 microlitros de cada muestra en geles de SDS-PAGE al 10 %, junto con 4 microlitros de estándares de proteínas preteñidos.
Inspeccione visualmente el gel para identificar las fracciones que parecen contener integrasa del virus espumoso prototípico casi pura. Combine estas fracciones y anote el volumen durante la pipetación. Este volumen suele ser de ocho a diez mililitros.