La identificación de los efectos de las mutaciones BRCA1 en recombinación homóloga utilizando células que expresan endógeno de tipo salvaje BRCA1

El objetivo general del siguiente experimento es probar variantes específicas en la proteína BRCA1 mediante un ensayo in vitro de recombinación homóloga. Esto se logra reemplazando la proteína BRCA1 de tipo silvestre endógena con la variante que se está analizando, mediante la transfección de ARN de interferencia corto específico para BRCA1 y un plásmido para reexpresar las proteínas variantes de prueba de BRCA1 en las células. Como segundo paso, se transfectan además el ARN de interferencia corto y el plásmido para expresar la variante mutante de BRCA1, junto con un plásmido para expresar la proteína ISCE1, que induce daño en el ADN en un sitio específico del genoma de la célula de prueba. A continuación, las células se incuban durante dos o tres días para permitir que ocurra el daño y la reparación del ADN. Los resultados obtenidos indican si variantes proteicas específicas de la proteína BRCA1 funcionan en la reparación del ADN mediante recombinación homóloga, basándose en el análisis por citometría de flujo de células que expresan GFP.

Esta técnica combina dos métodos establecidos con el fin de crear un sistema versátil para analizar variantes proteicas específicas en la reparación de daños en el ADN mediante recombinación homóloga. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que los métodos previamente establecidos dependían de líneas celulares que tenían una inactivación génica de BRCA uno. Utilizamos una línea celular más manejable derivada de células HELOC que permite la reducción de BRC uno mediante interferencia de ARN de la proteína endógena y la adición posterior de la proteína de prueba en estas células.

Ahora que expresamos una variante de la proteína BRC1, podemos realizar pruebas para la recombinación homóloga. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la muerte celular excesiva durante el procedimiento. Es importante contar con una condición de transfección cuidadosamente establecida que maximice el efecto de la reacción de recombinación mientras se limita la citotoxicidad.

Antes del inicio de este protocolo, la línea celular hela DR 13 nueve fue establecida mediante la transfección de células hela con el plásmido P-D-R-G-F-P. Mantenga la línea celular en placas de Petri de 10 centímetros con puro micina para la selección de células transfectadas de manera estable. El sustrato de recombinación en el plásmido P-D-R-G-F-P y en los transformantes estables contiene dos alelos inactivos de GFP. Un alelo es inactivo debido a la inclusión del sitio de reconocimiento de 18 pares de bases para la enzima de restricción ISCE uno.

En su secuencia codificante, la expresión de ISCE1 en estas células crea una rotura de ADN de doble cadena o DSB en el segundo alelo de GFP inactivo. La porción de su secuencia correlacionada con el sitio I-SCE1 en el primer alelo es de tipo silvestre. Este segundo alelo de GFP puede funcionar como donador de secuencia para la reparación por recombinación homóloga del DSB y daría como resultado un alelo de GFP activo, que se detecta fácilmente mediante citometría de flujo el día anterior a la primera transfección.

Obtenga un plato de 10 centímetros con células hela DR 13 nueve que estén al menos en un 90 % confluentes. Incube las células con tripsina durante dos a tres minutos en un mililitro. Detenga la reacción añadiendo nueve mililitros de D-M-E-M-F-B-S y mezcle bien la suspensión celular mediante pipeteo. Añada 40 microlitros de células tratadas con tripsina por pocillo a una placa de 24 pocillos en 0,5 mililitros de D-M-E-M-F-B-S. Incube las células a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante la noche.

El primer día, las células deben tener una confluencia entre el 40 y el 50 %. Inicie la transfección mezclando tanto el ARNi para agotar el b RCA uno endógeno como el plásmido que expresa el mutante de b RCA uno en medio óptimo. Luego, combine los ácidos nucleicos con lip en medio óptimo.

Continúe con la transfección por lipofección según las instrucciones del fabricante tras la transfección. Devuelva las células a la incubadora. Reemplace el medio cuatro a seis horas después por un medio que no contenga antibióticos.

Devuelva las células a incubar durante la noche en el segundo día. Desdoble las células agregando 0,3 mililitros del reactivo de tripsina triple a cada pocillo tras una breve incubación a 37 grados Celsius; suelte las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo en el reactivo de tripsina. Una vez que la tripsina haya actuado, transfiera las células desde la placa de 24 pocillos a una placa de seis pocillos que contenga dos mililitros de D-M-E-M-F-B-S para detener la actividad de la tripsina.

Deje que la placa de seis pocillos incube durante la noche en las mismas condiciones que antes, dos días después de la transfección inicial. Prepare el SIR A, el ADN plasmídico que expresa la mutante BRCA1 y el plásmido que expresa ISCE1 en 62,5 microlitros de Optum. Mezcle esta solución con 2,5 microlitros de LIPECTOMY 2060 y 2,5 microlitros de Optum.

Proceda a transfectar las células tras una incubación de cuatro a seis horas. Reemplace el medio por D-M-E-M-F-P-S sin antibióticos. Devuelva las células al incubador el día seis.

Se realiza la tripsinización de las células en cada pocillo mediante la adición de 0,5 mililitros del reactivo tripsina-EDTA. Detenga la reacción añadiendo dos mililitros de DMEM+FBS y recolecte las células mediante centrifugación a 1000 rpm durante cinco minutos a temperatura ambiente. Reuspenda las células en un mililitro de DMEM+FBS fresco y analice 10 000 células por pocillo para la expresión de GFP.

Mediante citometría de flujo, se seleccionan células individuales viables utilizando los parámetros de dispersión hacia adelante y de tamaño. Las células positivas para GFP se identifican mediante el detector de fluorescencia de GFP y los resultados se presentan en forma de histograma. Las células restantes pueden volver a sembrarse para su fotografía mediante fluorescencia.

La microscopía del BRCA1 deseado regula la vía de reparación de roturas de ADN de doble cadena mediante recombinación homóloga. Aquellas células que han llevado a cabo la reparación mediante recombinación homóloga se detectan fácilmente mediante microscopía fluorescente. La disminución de BRCA1 mediante ARNip provoca una marcada reducción en el número de células positivas para GFP detectadas.

La salida de la FAC es un histograma con la intensidad de GFP por célula en el eje X y el número de células en el eje Y. En ausencia del plásmido transfectado que expresa I-SCE1, no se detectan células positivas para GFP.

Los resultados en las columnas dos a seis se obtuvieron todos de células en las que se transfectó el plásmido que expresa ISC uno el día tres. En un conjunto típico de resultados provenientes de un solo experimento, el 15,5 % de las células son positivas para GFP tras la expresión de ISC uno y el agotamiento por ARNi control de un gen irrelevante; en comparación, el agotamiento de BRCA uno y la adición de un vector plasmídico vacío reducen la conversión GFP al 0,7 %. La adición de BRCA uno exógeno de tipo silvestre restauró completamente la recombinación homóloga, como se detectó al obtener entre un 15 y un 16 % de células positivas para GFP.

De manera similar, la expresión de otra variante de significado desconocido. La mutación BRCA1 I21B restauró completamente la función de recombinación homóloga dependiente de BRCA1. La recuperación con el mutante BRCA1 M18T tuvo un efecto similar al control con vector.

Dado que esta variante se expresó a niveles similares al de la proteína endógena, sugiere que la variante BRCA1 M18T es no funcional en la recombinación homóloga. Al intentar este procedimiento, es importante recordar monitorear el crecimiento de las células, que están creciendo lentamente y con baja confluencia, y que la cantidad de mezcla de transfección utilizada debe reducirse. También es importante eliminar el medio de transfección de manera oportuna.

Observamos que en los días posteriores a la transfección, hay una alta cantidad de citotoxicidad si se incluyen antibióticos en el medio. Por esta razón, todo el medio después del día uno carece de antibióticos tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación del cáncer de mama exploraran la genética de variantes de BRCA1 con significado clínico desconocido en clínicas oncológicas.

Esperamos que el ensayo funcional de BRC uno desarrollado en este trabajo permita mejorar la predicción de los efectos de las variantes de BRC uno en la predisposición al cáncer.