Purificación del ADN plásmido de las colonias de bacterias Utilizando el kit de Qiagen Miniprep

Soy del laboratorio de Mike Halen, Departamento de Fisiología y Biofísica, Universidad de California, Irvine. Hoy les mostraré cómo utilizar la minifabricación de colágeno para purificar ADN de bacterias. Realizo este procedimiento como un paso de un experimento de mutagénesis dirigida a un sitio específico.

Después de obtener el plásmido, secuenciaré el inserto para verificar que los clones seleccionados contengan las mutaciones deseadas. Antes de realizar la preparación mínima, presentaré brevemente lo que hicimos ayer. Para cultivar bacterias, necesito primero inocular cinco mililitros de LB A en tubos individuales.

Y como puede observarse, antes de introducir bacterias en el tubo, el medio es claro. Luego, utilizo un asa de siembra para inocular una colonia aislada desde una placa de agar para aire y cambio la punta cada vez para evitar contaminaciones. A continuación, coloco los tubos en un agitador y los incubo a 300 RPM durante al menos ocho horas, y normalmente podemos dejarlos toda la noche.

Hay tres tampones importantes del kit de mini preparación de colágeno. Son P uno, P dos y N tres. Normalmente colocamos P uno a cuatro grados porque contiene ARN; P dos lo dejamos a temperatura ambiente; y para N tres, lo preparamos justo antes del experimento tras ocho horas.

Como puede observarse, ahora el medio está turbio porque las bacterias están creciendo en su interior y colocaré cinco microlitros del medio en otra placa. Así, una vez que verifique los clones, podré regresar directamente a las bacterias sin necesidad de realizar otra transformación. Después de centrifugar el medio, puede verse un buen botón bacteriano en el fondo del tubo y eliminaremos el sobrenadante con lejía para evitar cualquier contaminación del ambiente, mientras que el botón permanece intacto.

Ahora añado el tampón P1 a las pastillas bacterianas. El tampón P1 es un tampón de resuspensión para resuspender las bacterias. Ahora pipetearé la solución hacia arriba y hacia abajo para mezclar las bacterias con el tampón.

En esta etapa, no desea observar ninguna paleta bacteriana en la solución. Ahora transferiré las bacterias resus-bender a un nuevo tubo de eppendorf. Siempre etiqueto mis tubos para poder rastrearlos y saber de qué clon proviene cada solución.

Ahora añadí el tampón P2 a cada tubo, y el tampón P2 es un tampón de lisis para lisar las bacterias. Después de añadir el tampón P2, se puede observar que la solución aún no está clara. Ahora invertiré todos los tubos varias veces para que la solución se mezcle bien.

Y ahora puede observarse que la solución se vuelve clara. Ahora añado el tampón N tres y a cada tubo le agrego tampón M tres, que es el tampón de neutralización. Una vez que añado el tampón N tres, inmediatamente observo la precipitación de las proteínas, pero igualmente los invierto varias veces para mezclar la solución completamente.

Después de mezclar bien la solución. Así es como debería verse después de que agregue tampón y tres. Ahora voy a utilizar el sge para centrifugar la precipitación de proteínas durante 10 minutos. Armé un Cal VAC seis s.

Coloco todas las piezas en orden y luego las conecto a un sistema de vacío. Ahora ayudo al calentador de preparación, sujetando la correa al colector. Hoy solo haremos uno, así que bloqueo los otros orificios.

Así que tenemos un buen vacío. Como pueden ver, etiqueté la correa de acuerdo con mis tubos y, una vez que enciendo el vacío, obtengo un buen vacío. Bien, después de centrifugar el tubo, pueden ver el sedimento de proteína en el fondo y el ADN debería seguir disuelto en el sobrenadante.

Ahora nuestra transferencia, el sobrenadante, que contiene ADN, a las tiras de preparación para el tampón de vacío. Debo mencionar que siempre necesitamos cambiar las puntas para prevenir la contaminación cruzada. Ahora enciendo el vacío. Ahora apago el vacío y añado el tampón PB para lavar la tira, que en este momento contiene ADN en el filtro.

Ahora añado la solución PB a la tira para lavarla, y las tiras aún contienen ADN en el filtro. Esta vez no necesito cambiar las puntas si no toco la tira. Ahora añado el tampón p a la tira de la misma manera que lo hice con el tampón pb.

Y haré esto dos veces después de encender el vacío. Como pueden ver, la solución P en este momento está pasando a través de la tira y dejaremos el vacío encendido durante otros cinco minutos para asegurarnos de que el filtro quede muy seco. Después de cinco minutos de vacío, saque la tira de la caja y envuélvala con una toalla Kim. Golpéela contra la mesa para eliminar el tampón P residual.

Y ahora puede observarse que queda poca cantidad de la tapa del tampón P y que el ADN aún debe estar en el filtro. Aquí están los tubos microrecogedores. Los etiqueté de acuerdo con la tira.

Ahora abro el vacío del carro y lo vuelvo a armar con los microtubos de recolección, asegurándome de que las abrazaderas coincidan con los microtubos. Así es como debería verse actualmente el manifold. A continuación se muestra el aspecto del manifold de vacío, que está preparado para eluir el ADN desde la tira hacia el microtubo.

La tira está en la parte superior y el tubo justo debajo, etiquetado de la misma manera. Ahora bien, añada agua estéril a la tira sin aplicar vacío y déjela reposar durante un minuto. Esta vez, cuando el vacío es prolongado, como puede observarse, el agua atraviesa la tira y entra en los microtubos de recolección.

El agua contiene el ADN. También dejo el vacío conectado durante un tiempo para asegurarme de que se recoja toda el agua. Estos son los microtubos de recolección con la solución de ADN después de este paso.

Hola, acabo de mostrarle cómo usar un kit de miniprep de calcio para purificar ADN de bacterias. Ahora he secuenciado el inserto para verificar los clones correctos y debo mencionar el uso de este método. La cantidad de ADN suele ser generalmente del orden de microgramos.

Y mucha suerte con sus experimentos. Gracias por vernos.