Name: La cristalización de proteínas de membrana en mesofases lipídico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Aprende a cristalizar proteínas de membrana usando fase lipídica cúbica (LCP) y ensayo LCP-FRAP para obtener cristales de alta calidad. Este método optimiza la cristalización para cristalografía de rayos X.

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Este trabajo fue financiado en parte por las subvenciones del NIH GM073197 y RR025336.

Un esquema típico de un experimento de cristalización meso se muestra en la Fig. 1 1,2. Cristalización pre-FRAP LCP-ensayos son opcionales, sin embargo, que puede acelerar significativamente el proceso de búsqueda de condiciones de cristalización inicial, especialmente en el caso de las proteínas de la membrana difícil 3. 1. La reconstitución de proteínas en la LCP <ol><li> Purificar una proteína de membrana de interés en una solución de detergente y se concentran los complejos de proteínas / detergente a ~ 10 - 20 mg / ml, teniendo cuidado de no sobre-concentrar el 1,4 detergente. </li><li> Transferencia de ~ 25 mg de lípidos LCP anfitrión (por lo general monoolein) o una mezcla de lípidos en un tubo de plástico de 1,5 ml y se incuba a 40 ° C durante unos minutos hasta que los lípidos se derrita. </li><li> Conecte un acoplador de la jeringa para un 100 L hermético jeringa. </li><li> Cargue la jeringa con el lípido fundido utilizando una pipeta de volumen variable. Registrar el volumen de los lípidos en la jeringa. </li><li> Carga otra jeringa 100 L con la solución de proteína en una solución de proteínas a los lípidos proporción 2 / 3 v / v. </li><li> Conecte los dos jeringas juntos a través del acoplador de la jeringa. </li><li> Empuje el émbolo alternativamente jeringa para mover los lípidos y proteínas a través del interior de la aguja del acoplador, de ida y vuelta, hasta que la mesofase lípidos se vuelve homogéneo. LCP se forma espontáneamente en la mezcla mecánica, y la proteína se reconstituye en la bicapa lipídica de la LCP. Formación de LCP puede ser verificado por su consistencia gelatinosa y transparente, y por la ausencia de birrefringencia cuando se observan bajo un microscopio equipado con polarizadores cruzados, o, si es posible, mediante el uso de un pequeño ángulo de difracción de rayos X-1. </li></ol> 2. LCP-FRAP cristalización pre-ensayos LCP-FRAP ensayos están diseñados para medir las propiedades de difusión de las proteínas de la membrana se reconstituye en LCP en una variedad de condiciones de selección 3. La difusión de largo alcance de las proteínas de membrana de LCP es esencial para la cristalización de éxito, sin embargo, la microestructura de la LCP limita la difusión de proteínas de gran tamaño o de agregados de proteínas oligoméricas. Una razón común para el fracaso de un experimento de cristalización meso es una agregación de proteínas rápida que conduce a una pérdida de difusión. Se ha demostrado que el comportamiento de agregación de una proteína depende de la construcción de proteína en particular, los lípidos de acogida y la composición de la solución de detección 3. <ol><li> Etiqueta de la proteína con un tinte fluorescente (Cy3 o similar) en una proporción de proteína / tinte de ~ 100 / 1, quitar el tinte sin reaccionar y concentrar la proteína de ~ 1 mg / ml. Etiqueta, ya sea libre o aminas tioles libres. Cuando el etiquetado aminas libres, use pH entre 7 y 7,5 para la etiqueta predominantemente libres N-terminal. Tenga en cuenta que el etiquetado de amino también pueden etiquetar los lípidos co-purifica con la proteína de 2,3. </li><li> La reconstitución de la proteína marcada en LCP como se describe en la sección 1). </li><li> Configurar placas de ensayo como se describe en la sección 3) utilizando LCP-FRAP soluciones de control en lugar de dos pantallas de la cristalización. </li><li> Las placas se incuban a 20 ° C en la oscuridad durante al menos 12 horas para lograr un estado de equilibrio. </li><li> Coloque uno de los platos en la estación de LCP-FRAP y se centran en el primer pozo con un objetivo de 10x. </li><li> Adquirir 5 imágenes fluorescentes para capturar la primera pre-blanqueado estado. </li><li> Activar el láser. La potencia del láser y el número de impulsos se debe ajustar a la lejía ~ 30 - 70% de la proteína marcada en el centro de la mancha blanqueada. </li><li> Inmediatamente después de la activación del láser, iniciar la grabación de un ayuno posterior a la secuencia de blanqueo ~ 200 imágenes a la mayor velocidad posible. </li><li> Seguir con la grabación de una lenta después de la secuencia de blanqueo ~ 50 imágenes, seleccionar el tiempo entre las imágenes como 1.20 s, en función de la tasa de difusión de la proteína. </li><li> Integrar la intensidad en el interior del lugar de blanqueador en todos los marcos y corregirla para el blanqueo y la luz fluctuaciones de intensidad durante la adquisición de dividir la intensidad en el interior del lugar blanqueado por la intensidad promedio de un punto de referencia fuera del área de láser blanqueada. </li><li> Normalizar la intensidad corregida para que la intensidad de la pre-blanqueado igual a 1 y de la intensidad inicial blanqueada igual a 0. </li><li> Ajustar la curva de la intensidad normalizada en función del tiempo, F (t), utilizando la siguiente ecuación 5: F (t) = M x exp (-2T / t) x (I 0 (2T / t) + I 1 (2T / t)), (Eq.1) donde M es la fracción de moléculas que se difunden móvil, T es el tiempo de difusión característico, t es el tiempo real de cada fotograma grabado, I 0 y 1 son los 0 º y 1 º orden modificado las funciones de Bessel. </li><li> Calcular el coeficiente de difusión, D, como: D = R 2 / 4T, (ecuación 2) donde R es el radio de la mancha blanqueada. </li><li> No se muevao bien la siguiente y repita los pasos 2,5) - 2,13). </li><li> Compara las fracciones celulares y los coeficientes de difusión obtenidos para las condiciones de selección diferentes. Cristalización nuevo diseño basado en las pantallas de los componentes que facilitan la difusión de las proteínas y las condiciones de exclusión para que la difusión de las proteínas no se observó. Si la proteína no se difundieron en cualquiera de las condiciones de detección, estudiar la ampliación del espacio de proyección o está tratando de construir una nueva proteína. </li></ol> 3. Configuración de los ensayos de cristalización LCP <ol><li> La reconstitución de la proteína en la LCP como se describe en la sección 1). </li><li> La transferencia de la LCP proteína cargada en un 10 l impermeable a los gases jeringa conectada a un dispensador repetitivo jeringa. </li><li> Coloque una aguja corta extraíble (de calibre 26, 10 mm de longitud) a la jeringa l 10. </li><li> Prescindir de 200 bolos nL de LCP en la superficie de cuatro pozos adyacentes que forman un cuadrado de 2x2. </li><li> Superposición de cada uno de los bolos de LCP con una L de solución correspondiente pantalla de cristalización. </li><li> Cap cuatro pozos cargados con un cubreobjetos de 18 mm cuadrados. Aplique una presión suave sobre el cubreobjetos para sellar los pozos. </li><li> Repita los pasos 3,4) -3,6) con el siguiente grupo de 4 pozos hasta que el plato está lleno. </li><li> Incubar la placa a una temperatura constante, la comprobación periódica de la formación y crecimiento de cristales. </li></ol> 4. La cosecha de cristales LCP <ol><li> Coloque un plato con cristales de proteínas en un microscopio estéreo con zoom variable, equipado con un polarizador lineal de rotación y el analizador. </li><li> Centrarse en el bien de interés con un zoom de baja potencia para que el bien general se coloca en el campo de visión. </li><li> Puntuación del vidrio cubreobjetos en cuatro golpes haciendo un cuadrado dentro de los límites y con una esquina de una piedra de corte capilar de cerámica. </li><li> De prensa en todo el perímetro anotó con un fuerte fuerte unas pinzas de punta para propagar las rayas a través del espesor del vidrio cubreobjetos. </li><li> Perfore dos agujeros pequeños en las esquinas opuestas de la plaza, anotó. </li><li> L inyectar unos pocos de la solución de precipitación a través de uno de los agujeros para reducir la deshidratación durante las etapas posteriores. </li><li> Utilizando una sonda en ángulo aguja romper el vidrio a lo largo de uno o dos lados para liberar la plaza de desconexión. </li><li> Levante cuidadosamente la observación de cuadrados de vidrio para el bolo de fase cúbica. Si el bolo está atascada en el cubreobjetos, luego voltear el cuadrado de cristal y colóquelo en el fondo del pozo. </li><li> Añadir un extra l de la solución precipitante, complementado con un crio-protector, si es necesario, en la parte superior de la fase de bolo expuestos cúbicos en el pozo. </li><li> Aumentar la ampliación del microscopio y se centran en un cristal. </li><li> Ajustar el ángulo entre el polarizador y el analizador para aumentar el contraste entre el cristal birrefringente y el fondo, mientras se mantiene la luz suficiente para ver el circuito de la cosecha. </li><li> Seleccione un micromontajes MiTeGen con un diámetro que corresponde al tamaño de cristal y el cristal de la cosecha directamente de la LCP por el sacarla a la micromontajes. </li><li> Flash congelar la micromontajes con el cristal cosechado en nitrógeno líquido, y se lo enviaremos a una línea de luz sincrotrón para la fuente de rayos X de recogida de datos 6. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Una ingeniería humana beta 2 adrenérgicos acoplados a proteínas G del receptor (β 2 AR-T4L) se expresó en baculovirus Sf9 infectadas con células de insectos y se purifica en dodecylmaltoside (DDM) / colesterol hemisuccinato (CHS) una solución de detergente unido a un agonista parcial inverso carazolol 7. La proteína fue marcado con Cy3 éster de NHS y utiliza LCP-FRAP cristalización pre-ensayos (Figura 2). Pantallas grueso de cuadrícula basado en varias condiciones seleccionadas de los resultados de la LCP-FRAP ensayos producidos inicial cristal-como golpes (Figura 3). Una mayor optimización de las condiciones de precipitación de cristales de difracción producido de la calidad (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagrama de flujo de un experimento de cristalización LCP típico. Medidas en los cuadros de color gris no están descritas en los protocolos actuales. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. LCP-FRAP ensayo con β 2 AR-T4L/carazolol en LCP monoolein base. A) Los resultados de un ensayo de LCP-FRAP realiza en un sistema automático de alto rendimiento el modo en el que cada muestra de una placa de 96 pocillos se blanquea de forma secuencial y la recuperación de la fluorescencia se mide después de una incubación de 30 minutos. Las recuperaciones obtenidas de fluorescencia, que representan la fracción de móviles en cada muestra, se trazan para todos 96 muestras. Las soluciones de detección contienen 0,1 M Tris pH 8, 30% v / v de PEG 400 en combinación con 48 diferentes sales en dos concentraciones diferentes. B) los perfiles de fluorescencia de recuperación de representante de variostante condiciones. Curvas sólidas representan la línea se ajusta a la ecuación. 1.El fracciones celulares y los coeficientes de difusión se determinan mediante las ecuaciones. 1 y 2. Rápida recuperación de menos del 10% de la muestra que contiene cloruro de sodio se debe a los lípidos marcados con fluorescencia co-purifica con la proteína. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Éxitos iniciales de cristal de β 2 AR-T4L/carazolol obtenidos por un examen de la malla gruesa alrededor de las condiciones más prometedoras identificadas por LCP-FRAP, que contiene sulfato de sodio (panel A) y Na formiato (panel B). La proteína está marcado con Cy3 éster de NHS y las imágenes fluorescentes son tomadas con excitación a 543 nm y emisión a 605 nm. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Optimizado cristales de β 2 AR-T4L/carazolol. Las imágenes de los cristales cultivados en presencia de sulfato de sodio (grupos A y B) y K-formato (paneles C y D) se toman en el modo de campo claro (grupos A y C) y el uso de polarizadores cruzados (los grupos B y D).

<ol><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).</li>
<li>Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+structure+determination+of+GPCRs%2C+a+membrane+protein+family+with+high+potential+as+pharmaceutical+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets.</a> Methods Mol. Biol. 654, 141-170 (2010).</li>
<li>Cherezov, V., Liu, J., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LCP-FRAP+assay+for+pre-screening+membrane+proteins+for+in+meso+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cryst.+Growth+Design%22%5BJournal%5D)">LCP-FRAP assay for pre-screening membrane proteins for in meso crystallization.</a> J. Cryst. Growth Design. 8, 4307-4315 (2008).</li>
<li>Misquitta, Y., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergents+destabilize+the+cubic+phase+of+monoolein%3A+implications+for+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Detergents destabilize the cubic phase of monoolein: implications for membrane protein crystallization.</a> Biophys. J. 79, 394-405 (2003).</li>
<li>Soumpasis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments.</a> Biophys. J. 41, 95-97 (1983).</li>
<li>Cherezov, V., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Hilgart, M. C., Sanishvili, R., Nagarajan, V., Stepanov, S., Fischetti, R. F., Kuhn, P., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rastering+strategy+for+screening+and+centering+of+microcrystal+samples+of+human+membrane+proteins+with+a+sub-10+micrometer+size+X-ray+synchrotron+beam%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Rastering strategy for screening and centering of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 micrometer size X-ray synchrotron beam.</a> J. R. Soc. Interface. 6, S587-S597 (2009).</li>
<li>Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li>
<li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).</li>
<li>Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+imaging+of+integral+membrane+protein+crystals+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases.</a> Anal. Chem. 82, 491-497 (2010).</li>
<li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+inexpensive+nanoliter-volume+dispenser+for+highly+viscous+materials+used+in+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">A simple and inexpensive nanoliter-volume dispenser for highly viscous materials used in membrane protein crystallization.</a> J. Appl. Cryst. 38, 398-400 (2005).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast%2C+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li>
<li>Cherezov, V., Fersi, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+screens%3A+compatibility+with+the+lipidic+cubic+phase+for+in+meso+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Crystallization screens: compatibility with the lipidic cubic phase for in meso crystallization of membrane proteins.</a> Biophys J. 81, 225-242 (2001).</li>
</ol>

Los protocolos proporcionan una guía visual básica de los pasos principales involucrados en la realización de experimentos de cristalización meso. Más en profundidad los detalles relacionados con estos protocolos, con énfasis en las posibles dificultades, las deficiencias o las rutas alternativas están disponibles en otros lugares 1,2. Opcional FRAP LCP-ensayos pueden ayudar en las primeras etapas para seleccionar la construcción de las proteínas más prometedores, lípidos LCP de acogida y los aditivos de lípidos, así como limitar el rango de posibles factores desencadenantes y las condiciones de tampón 3. Una vez que un golpe de cristalización inicial se encuentra, debe ser optimizado para obtener una mejor calidad de los cristales. Optimización de las condiciones de cristalización meso es esencialmente similar a la optimización de las condiciones de las proteínas solubles con la adición de parámetros adicionales asociados con la composición de la LCP 1. Cristales de proteína de la membrana lipídica crecido en mesofase suelen ser de menor tamaño que los cristales obtenidos en solución de detergente, pero más ordenado, por lo tanto, se benefician fuertemente el uso de líneas de luz disponible en microfocus modernas fuentes de radiación sincrotrón 6. Muchos de los procedimientos relacionados con la cristalización meso, incluyendo la creación de placas de cristalización o ensayo, la realización de ensayos de LCP-FRAP y la detección de cristales, han sido semi-o completamente automático 1,2,8,9, lo que permite la proyección de un amplio rango de condiciones mientras que el consumo de pequeñas cantidades de proteínas y lípidos. Por otro lado, reconstituciones de proteínas en LCP y la cosecha de cristal permanecen las operaciones manuales y más tedioso y, por tanto, tienen una necesidad de mejora.

<table><tbody><tr><td>100 &amp;mu;L de jeringa hermética para gases</td><td>Hamilton Co</td><td>7656-01</td><td>Se requieren 2 jeringas</td></tr><tr><td>10 &amp;mu;L de jeringa hermética para gases</td><td>Hamilton Co</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>Acoplador para jeringas</td><td>Hamilton Co</td><td>7770-02 30902</td><td>El acoplador puede fabricarse utilizando piezas disponibles, como se describe en las referencias 10</td></tr><tr><td>Dispensador repetitivo de jeringas</td><td>Hamilton Co</td><td>83700</td><td>El dispensador repetitivo de jeringas puede modificarse para reducir el volumen dispensado en aproximadamente 3 veces&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Aguja desmontable corta (0.375&amp;#8221;) con punta plana (estilo de punta 3, calibre 26)</td><td>Hamilton Co</td><td>7804-03</td><td></td></tr><tr><td>Placa de vidrio tipo sándwich de 96 pocillos</td><td>Marienfeld</td><td>08 900 03</td><td>Para operaciones manuales, resulta más conveniente armar la placa de vidrio tipo sándwich utilizando portaobjetos estándar para microscopio y cinta adhesiva doble con orificios perforados&lt;sup&gt;1,2,12&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63787-01</td><td></td></tr><tr><td>monooleína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7765</td><td></td></tr><tr><td>Pantallas de cristalización</td><td>Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience</td><td></td><td>La mayoría de las pantallas comerciales disponibles pueden utilizarse para el cribado inicial. Las condiciones que alteran consistentemente la LCP pueden diluirse 2 veces para mejorar la compatibilidad&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Piedra para corte de capilares</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-334</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de punta fina</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>510</td><td></td></tr><tr><td>Pinza afilada en ángulo</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13650</td><td></td></tr><tr><td>MicroMounts</td><td>MiTeGen</td><td>M1-Lxx-xx</td><td>Seleccionar el diámetro del MicroMount según el tamaño del cristal</td></tr></tbody></table>

la cristalización de proteínas de membrana en mesofases lipídico

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Las proteínas de membrana a cabo funciones críticas en las células vivas relacionadas con la transducción de señales, transporte y transformación de energía, y, como tal, están implicados en una multitud de disfunciones y enfermedades. Sin embargo, una comprensión estructural y funcional de proteínas de la membrana está muy a la zaga de sus socios soluble, principalmente, debido a dificultades relacionadas con su solubilización y la generación de los cristales de la calidad de difracción. La cristalización en mesofases lipídica (también conocida como la cristalización meso o LCP) es una técnica prometedora que se ha aplicado con éxito para obtener estructuras de alta resolución de rodopsinas microbianos, proteínas fotosintéticas, exterior barriles beta y los receptores de membrana acoplados a proteínas G. En meso cristalización se aprovecha de un ambiente de membrana como nativo y, normalmente, produce cristales con menor contenido en disolventes y ordenar mejor en comparación con los tradicionales de cristalización de soluciones detergentes. El método no es difícil, pero requiere una comprensión del comportamiento de los lípidos y la fase de prácticas en el manejo de materiales viscosos mesofase. Aquí se demuestra de una manera sencilla y eficaz de hacer LCP y la reconstitución de una proteína de membrana en la bicapa lipídica de la LCP utilizando un mezclador de jeringa, seguido por dispensar porciones nanolitros de LCP en un ensayo o una placa de cristalización, la realización de ensayos de pre-cristalización y la recolección de los cristales la matriz de LCP. Estos protocolos proporcionan una guía básica para abordar en los ensayos de cristalización meso, sin embargo, como con cualquier experimento de cristalización, la selección y optimización de extensas son necesarias, y el éxito no está garantizado necesariamente.

Los protocolos describen los pasos esenciales para la obtención de cristales de difracción de la calidad de una proteína de membrana a partir de la reconstitución de la proteína en una fase lipídica cúbicos (LCP), la búsqueda de las condiciones iniciales con LCP-FRAP antes de la cristalización de los ensayos, el establecimiento de ensayos LCP cristalización y los cristales de la cosecha .

La cristalización de proteínas de membrana en mesofases lipídico

Las proteínas de membrana desempeñan funciones críticas en las células vivas relacionadas con la transducción de señales, el transporte y las transformaciones energéticas y, como tales, son...

El objetivo general del siguiente procedimiento es obtener cristales de alta calidad de una proteína de membrana para la determinación estructural mediante cristalografía de rayos X. Esto se logra mediante la reconstitución de la proteína en la membrana de una fase cúbica lipídica y la incubación con una solución precipitante, lo que induce la nucleación y el crecimiento de cristales debido a la gran extensión del espacio de cristalización y a la retroalimentación limitada proveniente de los experimentos de cristalización. El ensayo de recuperación de fluorescencia en la fase cúbica lipídica tras BLANQUEO FOTOQUÍMICO o LCP Frap Prec fue desarrollado para seleccionar las condiciones de cristalización más prometedoras.Este ensayo reduce la cantidad de cribado y aumenta las probabilidades de obtener inicialmente cristalizaciones positivas. Una vez encontrados los primeros positivos, se establecen ensayos de optimización con el fin de mejorar el crecimiento de los cristales. Finalmente, los cristales optimizados se recolectan y congelan en nitrógeno líquido para la recopilación de datos en una fuente de sincrotrón.Los resultados muestran el uso efectivo del ensayo FRA en FCL para obtener cristales iniciales del receptor beta-2 adrenérgico en FCL, cuya optimización posterior condujo a cristales de calidad para difracción. Esta técnica aprovecha un entorno de membrana similar al nativo proporcionado por la fase cúbica laminar, y generalmente produce cristales con bajo contenido de solvente y mejor ordenamiento en comparación con la cristalización en soluciones de detergentes. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la alta viscosidad y las propiedades reomáticas de las fases lipídicas, lo que hace que estos materiales sean difíciles de manipular.Sin embargo, cuando se utilizan las herramientas adecuadas y se domina la técnica, este procedimiento no es más difícil que cualquier otra técnica de cristalización de proteínas y es susceptible de automatización y alto rendimiento. Así que comencemos. Purifique la proteína de membrana de interés en una solución con detergente y concentre los complejos proteína-detergente hasta aproximadamente 10 a 20 miligramos por mililitro.Transfiera aproximadamente 25 miligramos de un lípido huésped LCP A o una mezcla de lípidos a un tubo de plástico, e incube a 40 grados Celsius durante unos minutos hasta que el lípido se derrita. A continuación, sujete un acoplador de jeringa a una jeringa hermética al gas de 100 microlitros. Cargue la jeringa con el lípido fundido utilizando una pipeta de volumen ajustable.Registre el volumen del lípido en la jeringa y cargue otra jeringa de 100 microlitros con suficiente solución de proteína para obtener una relación de solución de proteína a lípido de dos a tres, volumen a volumen. Conecte ambas jeringas mediante el acoplador de jeringas. Presione alternativamente los émbolos de las jeringas para mover el lípido y la proteína a través de la aguja interna del acoplador, de un lado a otro, hasta que la fase mesomórfica del lípido se vuelva homogénea.El LCP se forma espontáneamente mediante mezcla mecánica y la proteína queda reconstituida en la bicapa lipídica del LCP. La formación del LCP puede verificarse por su consistencia transparente y gelatinosa, y por la ausencia de birrefringencia cuando se observa bajo un microscopio equipado con polarizadores cruzados o, si es posible, mediante difracción de rayos X de ángulo pequeño. Para iniciar los ensayos de FRAP en LCP, marque la proteína con un colorante fluorescente en una relación proteína:colorante de aproximadamente 100 a 1, como se describe en el protocolo escrito.Elimine el colorante no reactivo y concentre la proteína hasta aproximadamente un miligramo por mililitro. A continuación, reconstituya la proteína marcada en LCP de la misma manera que se hizo con la proteína no marcada. Prepare las placas de ensayo.Uso de soluciones de tamizaje con LCP. Primero, transfiera el LCP cargado con proteína a una jeringa hermética de 10 microlitros conectada a un dispensador de jeringas repetitivo; luego, coloque una aguja corta desmontable en la jeringa de 10 microlitros. Dispense bolos de 200 nanolitros de LCP sobre la superficie de cuatro pozos adyacentes, formando un cuadrado de dos por dos, y cubra cada bolo de LCP con un microlitro de la solución correspondiente de tamizaje LCP FRA.Una vez dispensada la solución de tamizaje, tape los cuatro pozos cargados con una cubreobjetos cuadrada de vidrio de 18 milímetros. Aplique una presión suave sobre la cubreobjetos para sellar los pozos. Repita este proceso para el siguiente conjunto de cuatro pozos hasta que toda la placa esté llena.Una vez llenada, cubra la placa con papel de aluminio. Incube las placas a 20 grados Celsius durante al menos 12 horas. Para alcanzar un estado de equilibrio, coloque una de las placas en la estación LCP Frap y enfoque el primer pocillo utilizando un objetivo de 10 aumentos.La adquisición de datos de FRAP se realiza automáticamente mediante un script de Image Pro en el cual el usuario introduce primero todos los parámetros de adquisición y luego pulsa el botón de inicio. Una secuencia típica de adquisición comienza grabando cinco imágenes previas al blanqueo, luego activa el láser de blanqueo sincronizado con la transmisión de una secuencia rápida de recuperación de aproximadamente 200 imágenes a la velocidad máxima posible, seguida de la obtención de una secuencia lenta de recuperación de 50 imágenes con intervalos de uno a 20 segundos entre imágenes, dependiendo de la velocidad de difusión de la proteína. Una vez finalizada la recopilación de datos, integre la intensidad dentro del punto de blanqueo y en puntos de referencia colocados fuera del área blanqueada con el láser en todos los fotogramas para corregir.La curva de intensidad integrada para las desviaciones causadas por fluctuaciones de luz y fotoblanqueo durante la adquisición de datos normaliza la intensidad corregida de modo que la intensidad previa al fotoblanqueo sea igual a uno y la intensidad inicial tras el fotoblanqueo sea igual a cero; ajuste la curva de la intensidad normalizada frente al tiempo según se describe en el protocolo escrito para obtener la fracción móvil y el coeficiente de difusión. Repita este procedimiento para el siguiente punto, compare las fracciones móviles y los coeficientes de difusión obtenidos para las diferentes condiciones de cribado. Diseñe pantallas de cristalización nu basadas en los componentes que facilitaron la difusión de la proteína y excluya las condiciones para las cuales no se observó difusión proteica, a fin de establecer ensayos de cristalización en LCP.Reconstituya la proteína en LCP como antes, luego prepare las placas de cristalización como para LCP frap, pero con soluciones de tamizaje de cristalización. Alternativamente, los ensayos de cristalización pueden prepararse de forma robótica una vez que las placas de cristalización hayan sido preparadas; incúbelas a una temperatura constante, revisando periódicamente la formación y el crecimiento de cristales. Una vez que los cristales de proteína hayan crecido, coloque una placa con los cristales bajo un microscopio estéreo con zoom variable equipado con un polarizador y analizador lineal rotatorio.Enfóquese en el pocillo de interés utilizando un aumento de baja potencia de modo que todo el pocillo quede dentro del campo de visión. Realice marcas en el cubreobjetos de vidrio con cuatro trazos, formando un cuadrado dentro de los límites del pocillo, utilizando una esquina afilada de una piedra cortante de capilares de cerámica. Presione alrededor del perímetro marcado con pinzas de punta fuerte y afilada para propagar los rayones a través del grosor del cubreobjetos.Con un punzón de vidrio, haga dos pequeños orificios en las esquinas opuestas del cuadrado marcado. Inyecte unas pocas microlitros de solución precipitante a través de uno de los orificios para reducir la deshidratación durante los pasos posteriores. Utilizando una sonda aguda en ángulo, rompa el vidrio a lo largo de uno o dos lados para liberar el cuadrado recortado.Levante cuidadosamente el cuadrado de vidrio observando el bolo de fase cúbica. Añada algunas microlitros adicionales de solución precipitante suplementada con un crioprotector si es necesario sobre el bolo de fase cúbica expuesto en el pocillo, aumente el aumento del microscopio y enfoque un cristal. Ajuste el ángulo entre el polarizador y el analizador para aumentar el contraste entre el cristal frt y el fondo, manteniendo suficiente luz para ver el lazo de cosecha.Luego, elimine el exceso de lípido y recoja el cristal directamente del LCP recogiéndolo con un soporte micro Mighty Gen que se ha seleccionado para tener un diámetro acorde al tamaño del cristal. Congele el soporte micro con el cristal recolectado en nitrógeno líquido y envíelo a una línea de haz de fuente de sincrotrón para la recopilación de datos de rayos X. El receptor beta adrenérgico dos fue marcado con el éster NHS S SI tres y utilizado en ensayos de cristalización LCP Frep prec en modo automático de alto rendimiento, en los cuales cada muestra de una placa de 96 pocillos se blanquea secuencialmente y se mide la recuperación de fluorescencia tras una incubación de 30 minutos. Las recuperaciones de fluorescencia obtenidas, que representan la fracción móvil en cada muestra, se grafican para las 96 muestras.Las soluciones de cribado contienen tris 0,1 molar pH ocho, PEG 400 al 30% volumen por volumen, combinado con 48 sales diferentes en dos concentraciones distintas. Se muestran los perfiles de recuperación de fluorescencia para varias condiciones representativas. Las curvas de línea continua representan ajustes de la intensidad normalizada frente al tiempo. La recuperación rápida de menos del 10% en la muestra que contiene cloruro de sodio se debe a lípidos marcados fluorescentemente.Se obtuvieron cristales iniciales mediante copurificación del receptor beta-2 adrenérgico en complejo con olol, utilizando una cribado en rejilla gruesa alrededor de las condiciones más prometedoras identificadas por LCP Frap que contenía sulfato de sodio y formiato de sodio. La posterior optimización de las condiciones del precipitante produjo cristales de calidad para difracción. A continuación, se muestran imágenes de los cristales crecidos en presencia de sulfato de sodio y formiato de potasio, tomadas en modo campo claro.Los mismos cristales también pueden observarse utilizando polarizadores cruzados. Una vez dominada, la reconstitución de proteínas en fases cúbicas lipídicas puede completarse en 10 a 15 minutos, y la preparación manual de una placa de cristalización de 96 pocillos dentro de una hora. El ensayo L tres B con envoltura en modo alto requiere aproximadamente dos horas por placa de 96 pocillos, y el cristal H tarda alrededor de 10 a 20 minutos por pocillo. Los procedimientos mostrados en este video proporcionan una guía básica para realizar ensayos de cristalización de proteínas.Sin embargo, como en cualquier experimento de cristalización, se requiere una criba extensa y una optimización, y no se garantiza necesariamente un resultado exitoso.

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