Name: La manipulación mecánica de las neuronas para controlar el desarrollo axonal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Aprende a manipular mecánicamente neuronas para controlar el desarrollo axonal usando agujas de vidrio calibradas. Este método permite medir fuerzas en el rango de microdinas y estudiar la biofísica de la elongación axonal.

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Agradecemos las importantes contribuciones del Dr. Robert E. Buxbaum en el desarrollo de esta metodología.

<ol><li>Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+growth+cone+adhesion+to+culture+surfaces+by+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation.</a> J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).</li>
<li>Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomechanics+of+neurite+outgrowth+from+chick+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons.</a> J Cell Sci. 110, 1179-1186 (1997).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeidemann%2C+SR+%22The+Neuron+in+Tissue+Culture%22">The Neuron in Tissue Culture</a>. Haynes, L. W. , J. Wiley and Sons. 105-119 (1999).</li>
<li>Lamoureux, P., Altun-Gultekin, Z. F., Lin, C., Wagner, J. A., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+is+required+for+growth+cone+function+but+not+neurite+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Rac is required for growth cone function but not neurite assembly.</a> J Cell Sci. 110, 635-641 (1997).</li>
<li>Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+can+specify+axonal+fate+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons.</a> J Cell Biol. 159, 499-508 (2002).</li>
<li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R., Martzke, N. R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li>
<li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li>
<li>Heidemann, S. R., Kaech, S., Buxbaum, R. E., Matus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observations+of+the+mechanical+behaviors+of+the+cytoskeleton+in+living+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observations of the mechanical behaviors of the cytoskeleton in living fibroblasts.</a> J Cell Biol. 145, 109-122 (1999).</li>
<li>Yoneda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+Exerted+by+a+Single+Cilium+of+Mytilus-Edulis+.1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Force Exerted by a Single Cilium of Mytilus-Edulis .1.</a> Journal of Experimental Biology. 37, (1960).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Tension+Produced+by+Nerve-Cells+in+Tissue-Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical Tension Produced by Nerve-Cells in Tissue-Culture.</a> Journal of Cell Science. 37, 391-410 (1979).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li>
<li>Fass, J. N., Odde, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+force-dependent+neurite+elicitation+via+anti-beta1+integrin+antibody-coated+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Tensile force-dependent neurite elicitation via anti-beta1 integrin antibody-coated magnetic beads.</a> Biophys J. 85, 623-636 (2003).</li>
<li>Yang, S., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+Force+Sensors+and+Their+Applications+in+the+Study+of+Cell+Mechanical+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mech%22%5BJournal%5D)">Microfabricated Force Sensors and Their Applications in the Study of Cell Mechanical Response.</a> Exp Mech. 49, 135-151 (2009).</li>
<li>Bernal, R., Melo, F., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drag+Force+as+a+Tool+to+Test+the+Active+Mechanical+Response+of+PC12+Neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Drag Force as a Tool to Test the Active Mechanical Response of PC12 Neurites.</a> Biophysical Journal. 98, 515-523 (2010).</li>
<li>Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+that+growth+cones+pull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct evidence that growth cones pull.</a> Nature. 340, 159-162 (1989).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+behavior+and+production+of+traction+force%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth cone behavior and production of traction force.</a> J Cell Biol. 111, 1949-1957 (1990).</li>
<li>O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+axonal+elongation%3A+force%2C+viscosity%2C+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Ngo, K., Reynolds, M., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-dish+incubator+for+live+cell+imaging+with+an+inverted+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Open-dish incubator for live cell imaging with an inverted microscope.</a> Biotechniques. 35, 708-708 (2003).</li>
</ol>

Técnicas a aplicar y medir fuerzas celulares tienen una larga historia 9. Nuestro método fue motivada inicialmente por el trabajo de Dennis Bray, que utiliza agujas de vidrio similar a la nuestra a &#39;remolque&#39; las neuronas a un ritmo constante, utilizando un dispositivo motorizado hidráulico 10. Hay muchos medios alternativos de la aplicación de fuerzas a las células que son: motores paso a paso 11, 12 bolas magnéticas, rayos microfabricated 13 y los flujos de fluidos <...

<table><tbody><tr><td>Tubo capilar R-6</td><td>Drummond Scientific</td><td>9-000-3111</td><td>Tubo de vidrio R-6, OD 0,9 mm, ID 0,6 mm, 8&quot;</td></tr><tr><td>Extractor BB-CH</td><td>Mecanex S.A., Ginebra, Suiza</td><td>BB-CH puller</td><td>Utilice el modo 4 Alt con CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000</td></tr><tr><td>Alambre de cromel 0,001&quot;</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPCH-001-50</td><td>Alambre para termopar sin funda, carrete de 50 pies, ahora llamado Chromega</td></tr><tr><td>Alambre de constantán 0,003&quot;</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPCI-003-50</td><td>Alambre para termopar sin funda, carrete de 50 pies</td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>Dumont Inox n.º 5</td></tr><tr><td>Soporte universal para microscopio con brazo articulado</td><td>Nikon Instruments</td><td>76135 o 90430</td><td>La mayoría de las marcas o tipos de soportes con brazo articulado funcionarán para este uso</td></tr><tr><td>Micromanipulador mecánico</td><td>Narishige International</td><td>M-152</td><td>Micromanipulador grueso de accionamiento directo de tres ejes</td></tr><tr><td>Micromanipulador hidráulico</td><td>Narishige International</td><td>MO-203</td><td>Ahora disponible como MMO-203, tipo de tres ejes móviles</td></tr><tr><td>Portaabrazaderas</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520145</td><td>Juego de 3</td></tr><tr><td>Soporte individual para instrumentos</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520142</td><td></td></tr><tr><td>Soporte doble para instrumentos</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520143</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador mecánico</td><td>Leica Microsystems</td><td>39430001</td><td>Montaje sobre poste, 1 soporte para probeta, modelo RH 430001</td></tr><tr><td>Micromanipulador mecánico con joystick</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520137</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM IRB</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Microscopio invertido</td></tr><tr><td>Mesa de aislamiento Vibraplane</td><td>Kinetic Systems</td><td>serie 1200</td><td>El nuestro es el modelo 1201-02-12</td></tr><tr><td>Ringcubador</td><td>Hecho en casa (ver referencia 19)</td><td></td><td>Referencia 19, requiere el controlador actualizado que se indica más abajo</td></tr><tr><td>Controlador de temperatura programable</td><td>Instrumart.com</td><td>Fuji Electric PXR3</td><td>Sustituye al controlador de temperatura PXV3 retirado</td></tr><tr><td>Nikon Diaphot TMD</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Microscopio invertido, aproximadamente de 1980</td></tr><tr><td>Nikon SMZ-10, binocular para disección</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Otros microscopios para disección funcionarán</td></tr></tbody></table>

la manipulación mecánica de las neuronas para controlar el desarrollo axonal

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Manipulación de células y la extensión de los axones neuronales se puede lograr con vidrio calibrado micro fibras capaces de medir y la aplicación de fuerzas en el rango de 1,2 10-1000 μdyne. Las medidas de fuerza se obtienen mediante la observación de la Hookean flexión de las agujas de cristal, que son calibrados por un método directo y empírico 3. Necesidades de equipo y procedimientos para la fabricación, la calibración, el tratamiento y el uso de las agujas de las células se describen con detalle. La fuerza de los regímenes anteriores, los diferentes tipos de células a las que estas técnicas se han aplicado pruebas de la flexibilidad de la metodología y se dan como ejemplos para la investigación futura 4.6. Las ventajas técnicas son las continuas &#39;visualización&#39; de las fuerzas producidas por la manipulación y la capacidad de intervenir directamente en una variedad de procesos celulares. Estos incluyen la estimulación directa y regulación del crecimiento axonal y la retracción del 7, así como el desprendimiento y mediciones mecánicas en cualquier tipo de cultivo celular 8.

Mediciones y la aplicación directa de las fuerzas sobre las neuronas en el rango de Microdyne 2000-1000 se logran con alta precisión utilizando agujas de vidrio calibrado. Esta metodología se puede utilizar para controlar y medir varios aspectos del desarrollo axonal, incluyendo la iniciación axonal, la tensión axonal, la velocidad de elongación axonal, y vectores de fuerza.

La manipulación mecánica de las neuronas para controlar el desarrollo axonal

Las manipulaciones celulares y la extensión de los axones neuronales pueden lograrse mediante microfibras de vidrio calibradas, capaces de medir y aplicar fuerzas en el...

El objetivo de este experimento consiste en alargar un axón mientras se miden con precisión las fuerzas. Esto se logra mediante la elaboración de una aguja de referencia de alambre directamente calibrada; a continuación, se preparan agujas de referencia de alambre, calibradas, intermedias y de trabajo en el rango de fuerza deseado. Posteriormente, se remolcan conos de crecimiento con una aguja de trabajo para alargar un axón.La elongación axonal resultante se registra y las fuerzas se miden en función de la flexión de la aguja calibrada. Este método puede responder preguntas clave sobre la biofísica de la elongación axonal. Comience este procedimiento utilizando un extractor de micropipetas ajustable y tubos capilares de vidrio para fabricar agujas con puntas cónicas de aproximadamente cuatro milímetros de longitud.Guarde las agujas en una placa de Petri de 160 milímetros con tapa. A continuación, prepare una aguja de calibración de alambre insertando un alambre de cromel de 0,001 pulgadas a través del interior de una aguja de vidrio cuya punta ha sido quebrada. Saque el alambre por la punta hasta una longitud de 26 milímetros y fíjelo en su lugar con pegamento instantáneo.Doble el

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Un método de ingeniería de tejidos único fue desarrollado para alargar las fibras nerviosas en numerosos cultura con una recapitulación de crecimiento de los axones se extienden, una forma de crecimiento del sistema nervioso por el que los nervios se alargan en conjunto con el crecimiento del cuerpo aumentando.

El crecimiento del axón Tramo: El Mecanotransducción de crecimiento neuronal

Estudio genético de la regeneración axonal en neuronas cultivadas de Adultos ganglio de la raíz dorsal

Morfogénesis neuronal y la migración son eventos cruciales que subyacen el desarrollo adecuado del cerebro. Aquí se describen los métodos para manipular genéticamente las neuronas granulares de cerebelo en cultivo y el cerebelo en desarrollo para la evaluación de la morfología y las características migratorias de las neuronas.

La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

Dos fotones de imágenes, acoplado a nanodissection láser, son herramientas útiles para el estudio de los procesos degenerativos y regenerativos en el sistema nervioso central con resolución subcelular. Este protocolo muestra cómo etiquetar, imagen y diseccionar las fibras individuales de escalada en la corteza cerebelosa in vivo.

Laser Nanocirugía del cerebelo Los axones<em&gt; En Vivo</em

Las técnicas de microscopía óptica junto con ensayos bioquímicos dilucidan la implicación de la exocitosis mediada por SNARE en la ramificación de los axones dependiente de la netrina. Esta combinación de técnicas permite identificar los mecanismos moleculares que controlan la ramificación de los axones y el cambio de forma de las células.

Utilizando metodologías combinadas para definir el papel de la membrana plasmática de entrega Durante Axon ramas y morfogénesis neuronal

Este protocolo describe el aislamiento de neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) aisladas de ratas y el cultivo de neuronas DRG en un sistema de cultivo celular estático preestirado para mejorar la alineación de los axones, con el posterior cocultivo de células de Schwann (SC) para promover la mielinización.

Un Enfoque para Mejorar la alineación y la mielinización de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal

Este manuscrito detalla la fabricación de redes neuronales de ingeniería micro-tejidos: construcciones tridimensionales de tamaño micrométrico compuestas por extensos tramos axonales alineados que abarcan la (s) población (es) neuronal (es) agregada (s) encerrada (s) en un hidrogel tubular. Estos andamios vivos pueden servir como relés funcionales para reconstruir o modular circuitos neuronales o como bancos de pruebas biofidelic imitando la neuroanatomía de la sustancia gris-blanca.

Anatomía Inspirada Tridimensional Micro-tejido Ingeniería de Redes Neuronales para la Reconstrucción del Sistema Nervioso, Modulación y Modelado

Este procedimiento describe cómo iniciar, extender y conectar rápidamente neuritas organizadas en cámaras microfluídicas usando perlas revestidas con poli-D-lisina fijadas a micropipetas que guían la elongación de las neuritas.

Rewiring Neuronal Circuits: Un Nuevo Método Para La Extensión Neurítica Rápida Y La Conexión Neuronal Funcional

Los ensayos de excrecencia de neuritas proporcionan un valor cuantitativo sobre los procesos neuronales regenerativos. La ventaja de este software semiautomático es que segmenta los cuerpos celulares y las neuritas por separado mediante la creación de una máscara y mide varios parámetros, como la longitud de las neuritas, el número de puntos de ramificación, el área del grupo de cuerpos celulares y el número de grupos celulares.

Estandarización de un novedoso software semiautomático para la medición del crecimiento de neuritas 

Este protocolo describe un sistema microfluídico que modela la dinámica metabólica neuronal después de la lesión axonal, lo que permite obtener imágenes, análisis multiómicos y estudios mecanicistas de remodelación metabólica intrínseca.

Chip microfluídico para la construcción de modelos de lesión axonal y permite el análisis multiómico

Aprende a manipular mecánicamente neuronas para controlar el desarrollo axonal usando agujas de vidrio calibradas. Este método permite medir fuerzas en el rango de microdinas y estudiar la biofísica de la elongación axonal.

La manipulación mecánica de las neuronas para controlar el desarrollo axonal

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