Name: Experimento perfil bioenergético utilizando células C2C12 mioblastos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-06T16:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Aprende a perfilar la función mitocondrial en células C2C12 utilizando el analizador XF 96. Este método mide respiración basal, producción de ATP, fuga de protones y capacidad de reserva para estudiar el metabolismo celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

En este experimento, las células C2C12 mioblastos se sembraron a una densidad dada en placas de cultivo celular Seahorse. El consumo de oxígeno basal (OCR) y las tasas de acidificación extracelular (ECAR) se miden para determinar las tasas de referencia. 1. Inyección de células Las células son metabólicamente perturbada por tres adiciones de diferentes compuestos (en la sucesión) que cambian el perfil bioenergético de la célula. Un grupo será el control, con el funcionamiento de los medios de comunicación añadido como el control de "compuestos". <ol><li> La primera inyección se oligomicina. Oligomicina inhibe la síntesis de ATP por el bloqueo del canal de protones de la parte F sintetasa o ATP (complejo V). En la investigación mitocondrial, que se utiliza para prevenir el estado 3 (fosforilación) la respiración. Con las células, que puede ser utilizado para distinguir el porcentaje de consumo de O2 dedicado a la síntesis de ATP y el porcentaje de consumo de O2 necesarios para superar la pérdida natural de protones a través de la membrana mitocondrial interna. </li><li> La segunda inyección se FCCP. FCCP (cianuro de carbonilo-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) es un ionóforo que es un portador de iones móviles. Se trata de un agente de desacoplamiento, ya que altera la síntesis de ATP por el transporte de iones de hidrógeno a través de la membrana mitocondrial en lugar del canal de protones de la ATP sintasa (complejo V). Este colapso del potencial de membrana mitocondrial conduce a un rápido consumo de energía y oxígeno sin la generación de ATP. En este caso, tanto OCR y ECAR aumentará, debido al desacoplamiento de OCR, y ECAR como el intento de las células para mantener su balance de energía mediante el uso de la glucólisis para generar ATP. FCCP tratamiento se puede utilizar para calcular el "repuesto" la capacidad respiratoria de las células que se define como la diferencia cuantitativa entre el máximo y el OCR no controlada inicial OCR basal. Se ha propuesto que el mantenimiento de cierta capacidad respiratoria, incluso en condiciones de máxima estímulo fisiológico o fisiopatológico es un factor importante que define la vitalidad y / o supervivencia de las células. La capacidad de las células a responder al estrés en las condiciones de la demanda de energía se incrementa en gran parte influenciada por la capacidad bioenergética de la mitocondria. Esta capacidad bioenergética es determinada por varios factores, incluyendo la capacidad de la célula para ofrecer soporte a la mitocondria y la capacidad funcional de las enzimas implicadas en el transporte de electrones </li><li> En la tercera inyección, la rotenona, un inhibidor de Complejo I, se añade a las células. Esto se apagará la respiración mitocondrial y permitirá a ambas las fracciones mitocondrial y no mitocondrial-que contribuyen a la respiración que se calcula. Se observará una disminución de la OCR, debido a la función mitocondrial alterada, con un aumento concomitante de la ECAR que la célula se desplaza hacia un estado más glucolítico con el fin de mantener su balance energético La rotenona es un inhibidor mitocondrial que impide la transferencia de electrones desde el centro Fe-S en el Complejo I de la ubiquinona (coenzima Q). Esta inhibición del complejo I evita que la energía potencial de NADH se convierte en energía utilizable en forma de ATP. </li></ol> 2. Reactivos y materiales <ol><li> Oligomicina, FCCP, y las soluciones de rotenona (Seahorse Estrés Mito Test Kit) </li><li> Ejecución de los medios DMEM (Seahorse # 100965-000) </li><li> DMSO (Sigma D8418) </li><li> Agua destilada (Gibco 15230-170) </li><li> Tampón de calibración (Seahorse Bioscience) </li></ol> 3. El crecimiento medio <ol><li> 500 ml de DMEM (Gibco 11965-092) </li><li> 10% de SFB (Hyclone SH90070.03) </li><li> 5 ml Penn / estreptomicina (Gibco 15140-122) </li><li> 5 ml de piruvato de sodio (Sigma S8636) </li><li> 5 ml Glutamax (Gibco 35050-061) </li></ol> 4. La siembra de Protocolo <ol><li> Se siembran las células en cultivos de células XF96 placas con 10.000 células / pocillo en 100 L de medio de cultivo y se coloca en 37 ° C incubadora con 10% de CO 2. </li><li> Las células se adhieren a la placa de la célula XF96 cultura dentro de 1 hora. </li><li> Las células de ensayo en XF96 24 horas después de la siembra. </li></ol> 5. Preparación de la plantilla de ensayo <ol><li> Utilizando el Asistente de ensayo (Anexo I), generar una plantilla con el diseño del siguiente grupo: <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Cuadrícula de diseño bien la identificación de las asignaciones de columna y el grupo </li></ol> 6. Preparación de compuestos <ol><li> Preparar los siguientes compuestos en XF DMEM ensayo medios de comunicación de la siguiente manera: 10 oligomicina uM, 30,0 uM FCCP, 20,0 M rotenona, Estas concentraciones representan la dilución de 10 veces que se hizo cuando los compuestos se inyecta en el pozo. Las concentraciones de trabajo son: 1 oligomicina uM, 3,0 uM FCCP, rotenona 2.0 M </li></ol> 7. Medios de cambio y de preparación de células <ol> Coloque la placa de la célula en la Estación de preparación XF <li> Ajuste el volumen final del medio a 160 l por pocillo. </li><li> Incubar a 37 ° C incubadora sin CO 2 durante 60 minutos para permitir que las células pre-equilibrio con el medio de ensayo. </li></ol> 8. Sensor de carga del cartucho <ol><li> Compuestos caliente a 37 ° C antes de la carga del cartucho del sensor y la carga de los compuestos en los puertos de inyección de la siguiente manera: <ol><li> Columnas 1-4: Cargar 16, 18 y 20 l de XF ensayo medios de comunicación (DMEM) en los puertos A, B y C, respectivamente. </li><li> Columnas 5-12: Carga de 16 l de oligomicina en los puertos de A Cargar 18 L de FCCP en los puertos B Carga de 20 l de la rotenona en los puertos C </li></ol></li></ol> 9. Comandos del Protocolo <table border="1"><tbody><tr><td> Comando </td><td> Tiempo (min) </td><td> Puerto </td></tr><tr><td> Calibrar </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Equilibrar </td><td></td><td></td></tr><tr><td> De inicio de bucle </td><td> 3X </td><td></td></tr><tr><td> Mezcla </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Esperar </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Medida </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Loop End </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Inyectar </td><td></td><td> A </td></tr><tr><td> De inicio de bucle </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Mezcla </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Esperar </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Medida </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Inyectar </td><td></td><td> B </td></tr><tr><td> De inicio de bucle </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Mezcla </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Esperar </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Medida </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Inyectar </td><td></td><td> C </td></tr><tr><td> De inicio de bucle </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Mezcla </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Esperar </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Medida </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Final </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Protocolo de comandos

<ol><li>Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale%3A+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).</li>
<li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochem J. 424, 99-107 (2009).</li>
<li>Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+regulates+mitochondrial+function+and+the+DNA+damage+response+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway.</a> Nature. , 459-7245 (2009).</li>
<li>Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+coupling+between+glucose+and+mitochondrial+metabolism+in+clonal+beta-cells+is+required+for+robust+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion.</a> J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).</li>
<li>Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reserve+capacity+in+endothelial+cells%3A+The+impact+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species.</a> Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).</li>
<li>Perez, J., Hill, B. G., Benavides, G. A., Dranka, B. P., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cellular+bioenergetics+in+smooth+muscle+cell+proliferation+induced+by+platelet-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Role of cellular bioenergetics in smooth muscle cell proliferation induced by platelet-derived growth factor.</a> Biochem J. 428, 255-267 (2010).</li>
<li>Morán, M., Rivera, H., Sánchez-Aragó, M., Blázquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Martín, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+bioenergetics+and+dynamics+interplay+in+complex+I-deficient+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts.</a> Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).</li>
<li>Cárdenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molgó, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+regulation+of+cell+bioenergetics+by+constitutive+InsP3+receptor+Ca2%2B+transfer+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria.</a> Cell. , 142-142 (2010).</li>
</ol>

Min Wu, por Bo Jensen, George W. Rogers, y David A. Ferrick son empleados de Seahorse Bioscience, que produce los reactivos y los instrumentos que aparecen en este artículo.

Este ensayo se deriva del experimento clásico para probar la función mitocondrial y sirve como marco de referencia para crear experimentos más complejos destinados a comprender los diversos cambios en el metabolismo celular, la función mitocondrial, y la bioenergética en general. Todos los compuestos utilizados en este experimento deben ser optimizados para la concentración que proporciona el máximo efecto. Es decir, uno debe llevar a cabo experimentos separados de valoración para determinar estos valores. Esto es especialmente importante con FCCP, como la curva de valoración tiende a ser bastante fuerte, y FCCP demasiado en realidad puede disminuir las respuestas de OCR. Rangos típicos (concentraciones finales) para poner a prueba sería la siguiente: <ul><li> 0,1 a 1,0 ug / ml de oligomicina </li><li> 0,1 a 5,0 uM FCCP </li><li> 0,1 a 1,0 uM rotenona </li></ul> Tenga en cuenta que las respuestas a cada compuesto anterior (especialmente FCCP) se verá influido por la composición de ensayo de los medios de comunicación (tipo base, [glucosa], [piruvato], la presencia / ausencia de BSA, etc.) Además, si el ensayo de los medios de comunicación XF composición se modifica la optimización será necesario volver a realizar. La presencia y concentración de piruvato es especialmente importante en la obtención de la capacidad respiratoria máxima debido a FCCP. Seahorse Bioscience ha observado en una serie de líneas de células que la omisión de piruvato anula la capacidad de las células a responder al máximo (por encima de línea de base) para FCCP. Por lo general, las concentraciones de piruvato 1-10 mm debe ser probado para entender la concentración óptima de piruvato para obtener la respiración máxima. Tenga en cuenta que [piruvato] Y [glucosa] puede ser necesario "cross-titulada" para obtener las condiciones óptimas para los medios de comunicación el experimento. Los resultados típicos de este experimento se presentan a continuación en un gráfico que muestra OCR en función del tiempo y otra que muestra el tiempo frente a ECAR: <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. OCR frente a tiempo <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. ECAR frente a tiempo Aquí observamos las respuestas esperadas en OCR y ECAR ya que las células se tratan con cada compuesto sucesivas. Para oligomicina, OCR disminuye como resultado de bloqueo de la síntesis de ATP mitocondrial en el Complejo V. Dado que las células son incapaces de sintetizar ATP a través de la fosforilación oxidativa, vuelven a la glicólisis para satisfacer su demanda de ATP, por lo que se observa un aumento de la ECAR. Como se indica anteriormente, FCCP actúa como un agente de desacoplamiento. Dado que las células deben ahora superar la pérdida de protones a través de la membrana mitocondrial interna, OCR aumenta significativamente a medida que más se consume O2 para bombear el exceso de protones al otro lado de la membrana mitocondrial. Por último, la rotenona inhibe la mitocondria del complejo I y III Complex, respectivamente, lo que hace que el flujo de electrones a cesar en la cadena de transporte de electrones, y por lo tanto el consumo de O2 se reduce drásticamente. <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Respiración parámetros Más allá de los cambios esperados en la respiración y la ECAR, una serie de parámetros respiratorios pueden ser obtenidos a partir de estos datos. Esto se resume en la figura anterior: Aquí vemos que podemos obtener información acerca de la respiración basal de las células, el porcentaje de consumo de O2 dedicada a la producción de ATP, así como el monto destinado a mantener el gradiente de protones (H + debido a la fuga). Además, podemos obtener el máximo de la frecuencia respiratoria en condiciones de respiración desacoplada (a veces conocido como la capacidad respiratoria de repuesto) y, finalmente, podemos determinar la cantidad de consumo de O2 no se debe a los procesos de las mitocondrias. Un creciente número de estudios que utilizan este perfil mitocondrial para evaluar la bioenergética celular, identificar la disfunción mitocondrial y para predecir la capacidad de las células a responder al estrés y / o insultos. Para más información y detalles acerca de este método experimental y la idea de la capacidad respiratoria de repuesto, consulte refieren a las siguientes publicaciones 1-8.

<table><tbody><tr><td>Soluciones de oligomicina, FCCP, rotenona y antimicina A</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td>Kit de prueba de estrés mitocondrial Seahorse</td></tr><tr><td>Medio de funcionamiento DMEM</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100965-000</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Agua destilada</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15230-170</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de calibración</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

experimento perfil bioenergético utilizando células c2c12 mioblastos

Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

La capacidad de medir el metabolismo celular y comprender la disfunción mitocondrial, ha permitido a los científicos de todo el mundo para avanzar en su investigación en la comprensión del papel de la función mitocondrial en la obesidad, la toxicidad de la diabetes, el envejecimiento, el cáncer, la función cardiovascular y la seguridad. El metabolismo celular es el proceso de asimilación del sustrato, tales como oxígeno, glucosa, ácidos grasos, y la glutamina, y la conversión de energía posterior a través de una serie de oxidación enzimática controlada y las reacciones de reducción. Estos resultados reacciones bioquímicas intracelulares en la producción de ATP, la liberación de los subproductos de calor y productos químicos, como el lactato y CO 2 en el medio extracelular. Información valiosa sobre el estado fisiológico de las células, y la alteración del estado de las células, se puede obtener a través de la medición de la tasa de oxígeno consumido por las células, un indicador de la respiración mitocondrial - La tasa de consumo de oxígeno - o OCR. Las células también generar ATP a través de la glucólisis, es decir: la conversión de glucosa a lactato, independiente de oxígeno. En los pozos de cultivo, el lactato es la principal fuente de protones. La medición del ácido láctico producido indirectamente a través de los protones liberados en el medio extracelular que rodea las células, lo que provoca la acidificación del medio proporciona la velocidad de acidificación extracelular - o ECAR. En este experimento, las células C2C12 mioblastos se sembraron a una densidad dada en placas de cultivo celular Seahorse. El consumo de oxígeno basal (OCR) y las tasas de acidificación extracelular (ECAR) se miden para determinar las tasas de referencia. Las células son metabólicamente perturbada por tres adiciones de diferentes compuestos (en la sucesión) que cambian el perfil bioenergético de la célula. Este ensayo se deriva de un experimento clásico para evaluar las mitocondrias y sirve como un marco con el cual construir experimentos más complejos destinados a comprender la función tanto fisiológicas y fisiopatológicas de la mitocondria y para predecir la capacidad de las células a responder al estrés y / o insultos.

Una descripción de un método para crear perfiles de la función mitocondrial en las células se proporciona. El perfil de las mitocondrias generan proporciona cuatro parámetros de la función mitocondrial que se puede medir en un experimento: la tasa de respiración basal, la respiración ATP-linked, fuga de protones, y la capacidad de reserva.

Experimento perfil bioenergético utilizando células C2C12 mioblastos

La capacidad de medir el metabolismo celular y de comprender la disfunción mitocondrial ha permitido que científicos de todo el mundo avancen en sus investigaciones sobre...

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar el estado funcional de las mitocondrias en células vivas y mitocondrias aisladas mediante la medición de múltiples parámetros del metabolismo oxidativo utilizando el analizador de flujo extracelular XF 96. Estos parámetros son la respiración basal, el recambio de ATP, la fuga de protones y la respiración máxima o capacidad respiratoria de reserva. Esto se logra añadiendo secuencialmente moduladores específicos de la respiración mitocondrial a células mioblastos C two C 12 y midiendo el cambio en la tasa de consumo de oxígeno, o OAR, un indicador de la respiración, y la conversión de glucosa en lactato, que genera ATP mediante la glucólisis.La otra vía energética principal en las células también se mide como ECAR o tasa de acidificación extracelular. Se pueden obtener resultados de perfilado mitocondrial que proporcionan información sobre el papel central que desempeña la función mitocondrial en la determinación de la longevidad celular. Hola, mi nombre es David Nichols.He sido un artista mitocondrial durante toda mi carrera, y la pieza de equipo más importante que he utilizado en mis estudios ha sido el electrodo de oxígeno. Si puede medir la velocidad de absorción de oxígeno bajo diferentes condiciones con mitocondrias aisladas, se obtiene una información enormemente importante. Cuando se pasa a células, especialmente células cultivadas en una placa de múltiples pocillos o sobre un cubreobjetos, los métodos clásicos no funcionan.Este es un problema importante, que se superó hace algunos años mediante el desarrollo de un ensayo en placas de múltiples pocillos que nos permite estudiar en paralelo la respiración celular en un formato de placa de múltiples pocillos. Lo que verá hoy es un experimento muy sencillo pero rico en información, que hemos diseñado para monitorear la función bioenergética mitocondrial básica en células cultivadas. Para comenzar, siembre las células en placas de cultivo celular XF 96 con 10.000 células por pocillo en 100 microlitros de medio de crecimiento, y colóquelas en un incubador a 37 grados Celsius con 10% de dióxido de carbono.Las células se pueden analizar en el XF 96, 24 horas después de sembrarlas utilizando el ensayo. El asistente genera una plantilla con la siguiente disposición de grupos. Las columnas de la uno a la 12 contienen todas 10.000 células C2C12.El grupo uno en azul se utiliza como células control. Al grupo dos en rojo se le administrarán los fármacos oligo Micina, FCCP y roone. A continuación, prepare los compuestos en medio de ensayo X-F-D-M-E-M según se describe en la parte escrita del protocolo.Oligomicina, FCCP, rotenona. Estos compuestos se dispensan previamente en el kit de prueba de estrés mitocondrial XF. Mediante el uso de la estación de preparación XF, reemplace el medio de crecimiento con medio de funcionamiento DMEM.Finalmente, incubar las células en un incubador a 37 grados Celsius sin dióxido de carbono durante 60 minutos para permitir que las células pre-equilibren con el medio de ensayo antes de agregar los compuestos inyectables al cartucho de sensores; calentar los compuestos a 37 grados Celsius. Luego, cargarlos en los puertos inyectores de la siguiente manera. Para las columnas uno a cuatro, cargar 16, 18 y 20 microlitros de medio de ensayo XF o DMEM en los puertos A, B y C, respectivamente.Para las columnas cinco a doce, cargue 16 microlitros de liga micina en el puerto A, 18 microlitros de FCCP en el puerto B y 20 microlitros de rot conocido en el puerto C. A continuación, defina los comandos del protocolo: establezca el bucle en tres veces. Mezcle durante tres minutos y mida durante tres minutos. A continuación, haga clic en iniciar.Siga las instrucciones en pantalla, que indicarán al usuario cuándo cargar el cartucho cuando finalice la calibración. Siga las indicaciones para el usuario y agregue la placa de cultivo celular para el experimento. Luego haga clic en continuar y permita que el ensayo se ejecute.Retire la placa cuando haya finalizado el experimento. Este ensayo se deriva del experimento clásico para perfilar la función mitocondrial y sirve como un marco sobre el cual construir experimentos más complejos destinados a comprender los diversos efectos de compuestos sobre el metabolismo celular, la función mitocondrial y las actividades bioenergéticas generales. Aquí observamos la respuesta esperada en la tasa de consumo de oxígeno a medida que las células fueron tratadas con cada compuesto sucesivo.Para la ligamina Oard, la disminución se produjo como resultado del bloqueo de la síntesis de ATP en el complejo mitocondrial cinco. Dado que las células no pudieron sintetizar ATP mediante la fosforilación oxidativa tras el tratamiento con ligamina mycin, recurrieron a la glucólisis para satisfacer su demanda de ATP. Por lo tanto, observamos un aumento en la tasa de acidificación extracelular (ECAR), un indicador de la glucólisis, tal como se ha demostrado previamente. FCCP actúa como un agente desacoplante y elimina la limitación del reingreso de protones.La respiración se acelera y ahora está limitada por el transporte de electrones. Finalmente, el rotenona inhibe el complejo I mitocondrial, lo que provoca que cese el flujo de electrones en la cadena de transporte de electrones y, por lo tanto, el consumo de oxígeno se redujo drásticamente. Aquí se obtiene información sobre la respiración basal de las células, el porcentaje de consumo de oxígeno destinado a la producción de ATP, así como la cantidad destinada al mantenimiento del gradiente de protones debido a la fuga de protones.Además, podemos obtener la tasa respiratoria máxima bajo condiciones de respiración desacoplada, a veces denominada capacidad respiratoria de reserva. Y finalmente, podemos determinar la cantidad de consumo de oxígeno no atribuible a procesos mitocondriales. Acaba de verlo con el seahorse.XF 96, una serie de experimentos que proporciona una gran cantidad de información sobre la bioenergética mitocondrial en la célula. El experimento básico, que es tan importante que llamamos experimento número uno, ofrece información sobre la respiración basal, el recambio de ATP, la fuga mitocondrial de protones y la capacidad respiratoria de reserva. Estos parámetros proporcionan información fundamental sobre el estado bioenergético de las mitocondrias en la célula.

bioenergetic-profile-experiment-using-c2c12-myoblast-cells

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un medio no invasivo para evaluar el éxito de trasplante de mioblastos se describe. El método se aprovecha de un gen de fusión informador unificada compuesta de genes cuya expresión se pueden obtener imágenes con diferentes modalidades de imágenes. Aquí, se hace uso de...

Imagen Molecular a Target trasplantó células progenitoras musculares

La glucólisis es un marcador metabólico definitorio en múltiples sistemas biológicos. El monitoreo de la glucólisis mediante la medición del flujo extracelular de H+ es común, pero requiere una corrección para que sea cuantitativa e inequívoca. Aquí, demostramos cómo recopilar y corregir datos de flujo extracelular para distinguir entre las fuentes respiratorias y glucolíticas de acidificación extracelular.

Medición y Análisis de la producción de ácido extracelular para Determinar glicolítica Rate

En este protocolo, se presentan los procedimientos para establecer modelos de distrofia miotónica de mioblastos 1, incluyendo el mantenimiento optimizado C2C12 celular, transfección de genes / transducción, y la diferenciación de los miocitos.

Modelado de la distrofia miotónica 1 en las células C2C12 mioblastos

mitocondrias de las células endoteliales son críticos para mantener la integridad-barrera hematoencefálica. Introducimos un protocolo para medir la función bioenergética en las células endoteliales vasculares cerebrales.

Evaluación de la función bioenergética en las células endoteliales vasculares cerebrales

El estudio del metabolismo es cada vez más relevante para la investigación inmunológica. Aquí, presentamos un método optimizado para medir la glucólisis y la respiración mitocondrial en esplenocitos de ratón y linfocitos T y B.

Un protocolo optimizado para analizar la glucólisis y respiración mitocondrial en los linfocitos

El objetivo de este protocolo es espectrofotometría monitor plasma trans membrana transporte de electrones utilizando aceptadores del electrón extracelular y analizar las interacciones enzimáticas que pueden ocurrir con estos aceptadores del electrón extracelular.

Medición de transporte de electrones membrana Trans-Plasma por C2C12 miotubos

Proporcionamos un protocolo para derribar genes que codifican las proteínas de matriz extracelular (ECM) en los mioblastos C2C12 utilizando ARN de horquilla pequeña (sh). Apuntando a ADAMTSL2 como ejemplo, describimos los métodos para la validación de la eficiencia de derribo en el ARNm, la proteína y el nivel celular durante la diferenciación de mioblasto c2C12 a miotubo.

Derribo estable de genes que codifican proteínas de matriz extracelular en la línea celular de mioblaste C2C12 utilizando small-Hairpin (sh)RNA

El ensayo de flujo metabólico celular en tiempo real mide la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de acidificación extracelular, que corresponde a la producción mitocondrial y glicolítica de trifosfato de adenosina, utilizando sensores de pH y oxígeno. El manuscrito explica un método para comprender el estado energético de los osteoblastos y la caracterización e interpretación del estado bioenergético celular.

Uso del analizador de flujo metabólico celular en tiempo real para monitorear la bioenergética de osteoblastos

El estado metabólico de las células epiteliales pigmentarias de la retina humana (H-RPE) refleja su salud y función. Aquí se presenta un protocolo optimizado para examinar el flujo metabólico en tiempo real de H-RPE utilizando respirometría de alta resolución.

Análisis en tiempo real de la bioenergética en células epiteliales pigmentarias de la retina humana primaria mediante respirometría de alta resolución

Las células mononucleares aisladas de sangre periférica se pueden utilizar para el análisis de funciones y trastornos inmunitarios, enfermedades metabólicas o funciones mitocondriales. En este trabajo se describe un método estandarizado para la preparación de PBMCs a partir de sangre total y su posterior criopreservación. La criopreservación hace que este tiempo y lugar sean independientes.

Criopreservación y Evaluación Bioenergética de Células Mononucleares de Sangre Periférica Humana

Aprende a perfilar la función mitocondrial en células C2C12 utilizando el analizador XF 96. Este método mide respiración basal, producción de ATP, fuga de protones y capacidad de reserva para estudiar el metabolismo celular.

Experimento perfil bioenergético utilizando células C2C12 mioblastos

Explorar más videos