Experimento perfil bioenergético utilizando células C2C12 mioblastos
6 de diciembre de 2010
Una descripción de un método para crear perfiles de la función mitocondrial en las células se proporciona. El perfil de las mitocondrias generan proporciona cuatro parámetros de la función mitocondrial que se puede medir en un experimento: la tasa de respiración basal, la respiración ATP-linked, fuga de protones, y la capacidad de reserva.
El objetivo general del siguiente experimento es evaluar el estado funcional de las mitocondrias en células vivas y mitocondrias aisladas mediante la medición de múltiples parámetros del metabolismo oxidativo utilizando el analizador de flujo extracelular XF 96. Estos parámetros son la respiración basal, el recambio de ATP, la fuga de protones y la respiración máxima o capacidad respiratoria de reserva. Esto se logra añadiendo secuencialmente moduladores específicos de la respiración mitocondrial a células mioblásticas C two C 12 y midiendo el cambio en la tasa de consumo de oxígeno, o OAR, un indicador de la respiración, y la conversión de glucosa en lactato, que genera ATP mediante la glucólisis.
La otra vía energética principal en las células también se mide como ECAR o tasa de acidificación extracelular. Se pueden obtener resultados de perfilado mitocondrial que proporcionan información sobre el papel central que desempeña la función mitocondrial en la determinación de la longevidad celular. Hola, mi nombre es David Nichols.
He sido un artista mitocondrial durante toda mi carrera, y la pieza de equipo más importante que he utilizado en mis estudios ha sido el electrodo de oxígeno. Si puedes medir la velocidad de consumo de oxígeno bajo diferentes condiciones con mitocondrias aisladas, obtienes una información enormemente importante. Cuando pasas a células, especialmente células cultivadas en una placa de múltiples pocillos o sobre un cubreobjetos, los métodos clásicos no funcionan.
Este es un problema importante, que se superó hace algunos años mediante el desarrollo de un ensayo en placas de múltiples pocillos que nos permite estudiar en paralelo la respiración celular en un formato de placa de múltiples pocillos. Lo que verá hoy es un experimento muy sencillo pero rico en información, que hemos diseñado para monitorear la función bioenergética mitocondrial básica en células cultivadas. Para comenzar, siembre las células en placas de cultivo celular XF 96 con 10.000 células por pocillo en 100 microlitros de medio de crecimiento, y colóquelas en un incubador a 37 grados Celsius con 10% de dióxido de carbono.
Las células se pueden analizar en el XF 96, 24 horas después de sembrarlas utilizando el ensayo. El asistente genera una plantilla con la siguiente disposición de grupos. Las columnas uno a doce contienen todas 10.000 células C2C12.
El grupo uno en azul se utiliza como células control. Al grupo dos en rojo se le administrarán los fármacos oligo Micina, FCCP y roone. A continuación, prepare los compuestos en medio de ensayo X-F-D-M-E-M según se describe en la parte escrita del protocolo.
Oligomicina, FCCP, rotenona. Estos compuestos se dispensan previamente en el kit de prueba de estrés mitocondrial XF. Mediante el uso de la estación de preparación XF, reemplace el medio de crecimiento con medio de funcionamiento DMEM.
Finalmente, incubar las células en un incubador a 37 grados Celsius sin dióxido de carbono durante 60 minutos para permitir que las células pre-equilibren con el medio de ensayo antes de agregar los compuestos inyectables al cartucho sensor desde los compuestos a 37 grados Celsius. Luego, cargarlos en los puertos inyectores de la siguiente manera. Para las columnas uno a cuatro, cargar 16, 18 y 20 microlitros de medio de ensayo XF o DMEM en los puertos A, B y C, respectivamente.
Para las columnas cinco a doce, cargue 16 microlitros de todos los liga micina en el puerto A, 18 microlitros de FCCP en el puerto B y 20 microlitros de rot conocida en el puerto C. A continuación, defina los comandos del protocolo: establezca el bucle en tres veces. Mezcle durante tres minutos y mida durante tres minutos. A continuación, haga clic en iniciar.
Siga las instrucciones en pantalla, que indicarán al usuario cuándo cargar el cartucho cuando finalice la calibración. Siga las indicaciones para el usuario y agregue la placa de cultivo celular para el experimento. Luego haga clic en continuar y permita que el ensayo se ejecute.
Retire la placa cuando haya finalizado el experimento. Este ensayo se deriva del experimento clásico para perfilar la función mitocondrial y sirve como un marco sobre el cual construir experimentos más complejos destinados a comprender los diversos efectos de compuestos sobre el metabolismo celular, la función mitocondrial y las actividades bioenergéticas generales. Aquí observamos la respuesta esperada en la tasa de consumo de oxígeno cuando las células fueron tratadas con cada compuesto sucesivamente.
La actividad de la mitocondria disminuyó como resultado del bloqueo de la síntesis de ATP en el complejo mitocondrial cinco. Dado que las células no pudieron sintetizar ATP mediante la fosforilación oxidativa tras el tratamiento con mitomicina, recurrieron a la glucólisis para satisfacer su demanda de ATP. Por lo tanto, observamos un aumento en la tasa de acidificación extracelular (ECAR), un indicador de la glucólisis, como se ha demostrado previamente. El FCCP actúa como agente desacoplante y elimina la limitación del reingreso de protones.
La respiración se acelera y ahora está limitada por el transporte de electrones. Finalmente, el rotenona inhibe el complejo I mitocondrial, lo que provoca que cese el flujo de electrones en la cadena de transporte de electrones y, por lo tanto, el consumo de oxígeno se redujo drásticamente. Aquí se obtiene información sobre la respiración basal de las células, el porcentaje de consumo de oxígeno destinado a la producción de ATP, así como la cantidad destinada al mantenimiento del gradiente de protones debido a la fuga de protones.
Además, podemos obtener la tasa respiratoria máxima bajo condiciones de respiración desacoplada, a veces denominada capacidad respiratoria de reserva. Y finalmente, podemos determinar la cantidad de consumo de oxígeno no atribuible a procesos mitocondriales. Acabas de verlo con el seahorse.
XF 96, una serie de experimentos que proporciona una gran cantidad de información sobre la bioenergética mitocondrial en la célula. El experimento básico, que es tan importante que lo llamamos experimento número uno, ofrece información sobre la respiración basal, el recambio de ATP, la fuga mitocondrial de protones y la capacidad respiratoria de reserva. Estos parámetros brindan información fundamental sobre el estado bioenergético de las mitocondrias en la célula.
Descripción general
Este artículo describe un método para perfilar la función mitocondrial en células vivas utilizando el analizador de flujo extracelular XF 96. El método mide parámetros clave de la respiración mitocondrial, incluyendo la tasa de respiración basal, la respiración vinculada a ATP, la fuga de protones y la capacidad de reserva.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Bioenergética
Antecedentes
- Las mitocondrias desempeñan un papel crucial en el metabolismo energético celular.
- Comprender la función mitocondrial es esencial para obtener conocimientos sobre la longevidad celular.
- Los métodos tradicionales para medir la respiración mitocondrial tienen limitaciones en células cultivadas.
- El analizador XF 96 permite la evaluación de alto rendimiento de la función mitocondrial.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para evaluar la función mitocondrial en células cultivadas.
- Medir múltiples parámetros del metabolismo oxidativo en un solo experimento.
- Proporcionar información sobre el estado bioenergético de las células.
Métodos Utilizados
- Las células se siembran en placas XF 96 y se incuban.
- Se añaden secuencialmente moduladores específicos de la respiración mitocondrial.
- Se miden la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR).
- Los datos se analizan para determinar varios parámetros de la función mitocondrial.
Resultados principales
- Se midieron con éxito la respiración basal, el recambio de ATP y la fuga de protones.
- El tratamiento con FCCP aumentó la respiración, lo que indica actividad mitocondrial desacoplada.
- El tratamiento con rotenona redujo el consumo de oxígeno, destacando el papel del complejo I.
- Los resultados proporcionan un perfil completo de la bioenergética mitocondrial.
Conclusiones
- El analizador XF 96 es una herramienta eficaz para el perfilado mitocondrial.
- Este método puede utilizarse para explorar los efectos de diversos compuestos sobre la función mitocondrial.
- Comprender la dinámica mitocondrial es fundamental para la investigación en metabolismo celular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El perfilado bioenergético mitocondrial permite la validación temprana de objetivos al vincular los efectos del compuesto con métricas funcionales de respiración y glucólisis. Este ensayo proporciona lecturas cuantitativas basadas en mecanismos que respaldan la confianza predictiva en la identificación de fármacos promisorios y la reducción de riesgos preclínicos. Establece la función mitocondrial como un biomarcador trasladable para modelos de enfermedades metabólicas y evaluación de seguridad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la medición del recambio de ATP y la fuga de protones como indicadores directos de la eficiencia del acoplamiento mitocondrial.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de objetivos mediante la modulación dependiente de la dosis del OCR y el ECAR en células vivas.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al identificar compuestos que inducen estrés metabólico o desacoplamiento antes del cribado fenotípico.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Establece mediciones estándar de OCR y ECAR como línea base para ensayos reproductibles de compuestos en células mioblastos C2C12.
- Salida cuantitativa: Proporciona lecturas paralelas de OCR y ECAR para distinguir el desplazamiento glucolítico de la inhibición respiratoria.
- Escalabilidad: Utiliza el formato XF 96 para perfiles metabólicos multipocillo y resueltos en el tiempo, compatibles con flujos de trabajo listos para automatización.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Modela la disfunción mitocondrial en la obesidad, la diabetes y el envejecimiento mediante cambios medibles en la respiración basal y máxima.
- Continuidad traslacional: Relaciona respuestas metabólicas agudas con estados patofisiológicos crónicos mediante la capacidad respiratoria de reserva y la compensación glucolítica.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Orienta criterios de avance o detención al cuantificar la reserva respiratoria y la fuga de protones como biomarcadores tempranos de toxicidad mitocondrial.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El ensayo se integra en el continuo de descubrimiento desde el compromiso con el blanco hasta la optimización del fármaco líder, proporcionando lecturas metabólicas funcionales que vinculan la actividad bioquímica con el fenotipo celular.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la medición de cómo los compuestos alteran la respiración mitocondrial y la glucólisis en tiempo real.
- Selección: Proporciona salidas cuantitativas de OCR y ECAR listas para ensayos, para la confirmación de resultados positivos y la triangulación del mecanismo de acción.
- Análisis: Permite comparar la respiración vinculada al ATP, la fuga de protones y la capacidad de reserva para clasificar compuestos según su riesgo metabólico.
- Investigación Traductiva: Conecta respuestas bioenergéticas agudas con modelos preclínicos de enfermedades metabólicas a través de vías conservadas en sistemas de mioblastos.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma reutilizable de fenotipificación metabólica en múltiples áreas terapéuticas, incluyendo oncología, neurodegeneración y enfermedades raras.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al desacoplar la producción de ATP del flujo de electrones y la fuga de protones.
- Valor operativo: Estandariza el perfilado metabólico mediante la inyección secuencial de inhibidores y la medición en tiempo real del flujo.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al identificar deficiencias mitocondriales en fases tempranas, reduciendo la eliminación tardía en programas para enfermedades metabólicas.
- Impacto en la cartera: Permite el avance ajustado al riesgo al cuantificar la capacidad respiratoria de reserva como biomarcador de la resiliencia celular.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en farmacología mitocondrial y en el manejo del analizador Seahorse XF.
- Depende del acceso a cartuchos sensores XF 96, puertos de inyección y optimización del medio de ensayo.
- Necesita la estandarización entre equipos en cuanto a densidad de siembra celular, condiciones de preincubación y preparación de compuestos.
- Implica consideraciones de adaptación para células primarias, líneas no adherentes o modelos tridimensionales distintos de los mioblastos C2C12.
- Está limitado por la duración del ensayo y las restricciones de solubilidad de los compuestos en los puertos de inyección.
