Una analítica Caja de Herramientas para la Evaluación Integral de bioquímica, estructural y transcriptoma de biopelículas oral mediada por Streptococcus mutans

Las biopelículas formadas en las superficies dentales son muy complejas y estructuradas. Comunidades microbianas enredadas en una matriz extracelular, que están expuestas a constantes desafíos ambientales. El objetivo general aquí es mostrar dos componentes específicos de una caja de herramientas analíticas diseñada para facilitar los estudios estructurales y moleculares, teniendo en cuenta la naturaleza compleja de las biopelículas orales mediante la combinación de una nueva técnica de imagen de fluorescencia con un software personalizado para el procesamiento y análisis de datos.

Esto se logra seleccionando primero ensayos específicos para el análisis de biopelículas, transcriptomas y estructuras, incluido un nuevo enfoque de imágenes confocales para la visualización simultánea de EPS y bacterias. El segundo paso del procedimiento es recopilar los datos brutos de los bioensayos. El tercer paso es procesar los datos brutos utilizando un software específico, incluido el nuevo duo stat para el análisis de colocalización.

El paso final es analizar los datos del proceso, incluido el uso de software de organización y minería de datos de microarrays, microarrays, visualizadores de datos o MDV. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren cómo los patógenos orales cambian su transcriptoma y la arquitectura de las biopelículas en respuesta a interacciones complejas entre la dieta y el microbio del huésped utilizando nuestra caja de herramientas analíticas integradas de forma única, que proporciona un análisis de biopelículas e interpretación de datos más completos. Hola, mi nombre es Michelle Kuh, profesora asociada en el centro de biología foral aquí en el Centro Médico Universal de Rochester.

Hoy presentamos una caja de herramientas analíticas para el análisis de biopelículas. Esta caja de herramientas puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación de biopelículas, como la forma en que se estructuran las células de biopelículas, cómo se organizan con la matriz extracelular y cómo responden a desafíos ambientales complejos a nivel transcriptómico. Mi nombre es Jean, ella, soy becaria postdoctoral en el laboratorio del Dr. K.

Hoy voy a demostrar la parte de imágenes de nuestra caja de herramientas. Hola, soy Aise Klein. Soy profesor asistente de investigación en el laboratorio del Dr.K.

Hoy presentaré el software MDV para el análisis de datos de microrayos. En este procedimiento, los discos hidroxi del apetito recubiertos de saliva se utilizan como sustitutos de la superficie dental en los que se cultivan biopelículas. En primer lugar, se añadan 2,8 mililitros de medio de cultivo inoculado con mutantes S en cada pocillo de una placa de 24 pocillos que proteja la placa de la luz con el colorante LOR 6 47 conjugado con dextrina en cada pocillo hasta una concentración final de un micromolar y pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar el colorante en el medio de cultivo.

A continuación, con pinzas estériles, lave los discos estériles de hidroxiapatita recubiertos de saliva dos veces en un tampón AB estéril para eliminar el exceso de saliva o los componentes salivales no unidos. A continuación, coloque los discos verticalmente en el medio de cultivo suplementado con tinte, asegurándose de que cada disco esté completamente sumergido. Cubra la placa con papel de aluminio e incélela a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5% durante 20 horas para permitir que se formen las biopelículas y que la textura conjugada se incorpore a los exo polisacáridos producidos por las células bacterianas.

Para etiquetar primero las células bacterianas, prepare una placa de 24 pocillos con 2,8 mililitros de agua Q mili Q estéril por pocillo. Agregue 1,5 microlitros de colorante cyto nine a cada pocillo hasta una concentración final de un micromolar y proteja la placa de la luz. Una vez que se haya formado la biopelícula, retire la placa que contiene los discos de la inmersión de la incubadora.

Lave cada disco en una solución de cloruro de sodio al 0,89%. A continuación, transfiéralos a la nueva placa que contiene el tinte cyto nine. Cubra la placa con papel de aluminio e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Una vez que las células se hayan teñido, lave las biopelículas y el cloruro de sodio como antes. Luego, con pinzas, libere las biopelículas del alambre en una placa de Petri que contenga cloruro de sodio. Envuelva la placa de Petri con papel de aluminio.

Las biopelículas ya están listas para su visualización mediante microscopía confocal utilizando un microscopio confocal de barrido láser. Escanee cada biopelícula en cinco a 10 posiciones seleccionadas al azar y genere series Z en cada posición. Para permitir reconstrucciones en 3D, abra las imágenes confocales y procéselas utilizando un software de espejo.

Esta representación tridimensional de imágenes confocales producidas con el programa, Amira, muestra una biopelícula de mutantes S formada en la superficie apática utilizando el procedimiento demostrado. Las células bacterianas y las microcolonias son visibles en verde y están incrustadas en la matriz de la biopelícula que contiene exo polisacáridos. En rojo, se puede generar una vista de cerca de un área seleccionada, que ilustra la relación estructural específica de las bacterias EPS a escala micro.

Utilice el programa duos stat para cuantificar la cantidad de colocalización de componentes de biopelícula separados, como las bacterias y los exo polisacáridos. En primer lugar, configure la ruta de acceso del duo stat recientemente desarrollado en la versión 5.1 de MATLAB y abra las carpetas de imágenes que contienen las imágenes de la serie Z de los dos componentes de la biopelícula. A continuación, elija dos canales que se correlacionarán y analizarán.

Las dos pilas de imágenes deben tener tamaños de píxel idénticos en todas las dimensiones y el mismo número de imágenes en cada pila. Establezca los umbrales para cada canal y siga las instrucciones en la interfaz del software e ingrese los datos en el archivo de procesamiento de datos para su análisis. Esta figura muestra cómo duo stack interpreta cuantitativamente la relación espacial entre las bacterias y la DBS.

Dentro de la pila de biofilm, Duo calcula la distribución vertical de bacterias y DPS desde la superficie del disco hasta la fase fluida, como se ve aquí en la línea verde para las bacterias y la línea roja para el EPS. También calcula la colocalización de bacterias y DPS a través del espesor de la biopelícula. Como se muestra en la línea amarilla, los datos muestran proporciones más altas de EPS que de bacterias en toda la profundidad de la biopelícula, y la mayoría de las células bacterianas están asociadas con EPS, especialmente desde las capas intermedias y superiores.

Con el fin de garantizar que se obtenga ARN de alta calidad a partir de biopelículas, recomendamos que la extracción de ARN se realice de acuerdo con el protocolo específico de biopelícula descrito en el artículo de Curian KU publicado en 2007. En la revista, se utilizan protocolos estándar de bioquímica analítica para la preparación de microarrays CD NA y ensayos cuantitativos de PCR en tiempo real. Con el fin de facilitar el análisis de los grandes conjuntos de datos generados por los experimentos de microarrays, hemos diseñado un software de minería y organización de datos, el visualizador de datos de microarrays o MDV, que está disponible en línea en www.oralgen.anl.gov.

Antes de enviar los datos a MDV, lleve a cabo un análisis estadístico como una prueba T pareada con un modelo de varianza aleatoria utilizando el software de herramientas de matriz BRB disponible en línea con un valor P de corte de 0,001 para la comparación de clases. En este ejemplo de análisis de cordero, se realizaron biopelículas cultivadas en tres concentraciones de azúcar distintas y cuatro puntos de tiempo. Se realizaron comparaciones pareadas, originando tres archivos BRB con una condición de 0,5% de sacarosa más 1% de almidón frente a 1% de sacarosa, condición B, 0,5% de sacarosa más 1% de almidón frente a 0,5% de sacarosa y condición C 0,5% de sacarosa frente a 1% de sacarosa.

Este panel representa el número de genes detectados expresados diferencialmente en cada condición y punto de tiempo evaluado por comparación de clases estándar utilizando la herramienta BRB array, lo que da como resultado un gran número de genes denominados datos brutos BRB. Para la demostración de MDV, nos centraremos en el punto de tiempo de 30 horas utilizando Excel. Convierta los datos sin procesar BRB en archivos de texto limitados por pestañas MDV.

Asegúrese de eliminar todas las letras que vienen con el número de pestaña del locus del gen, por ejemplo, en el nombre SMU punto 1432 C.Elimine la letra C, abra MDV. Abra el menú de archivos y elija seleccionar origen de anotación. Seleccione la opción de archivo plano cuando aparezca un cuadro de diálogo.

Utilice los botones Examinar para elegir los archivos que contienen anotaciones para la ontología génica, el número, la vía, la clasificación funcional, los datos y el nombre del gen. Ve a archivo e importa cada uno de los archivos convertidos al formato MDV. Cada archivo representa una condición experimental.

Compare los genes expresados en cada condición experimental A frente a B frente a C.In este ejemplo, utilizando la función del diagrama de Venn. Para esta demostración, nos centramos en genes expresados diferencialmente que están relacionados de forma única con las influencias de la sacarosa y el almidón en combinación. La función basada en el diagrama de Venn se utiliza para visualizar el número de genes únicos y compartidos expresados en estas diferentes condiciones y nos ayuda a identificar aquellos que se seleccionarán para un análisis más detallado.

Aquí seleccionamos solo los genes expresados diferencialmente que son únicos en la condición A y/o B, pero no los detectados en C como se muestra en gris como se muestra aquí. El MDV redujo en gran medida el número total de genes a analizar y, al mismo tiempo, filtró los genes no relevantes para el caso experimental. En el menú de archivos, elija la opción de exportación para guardar los datos.

Como archivos de pestañas limitadas, los archivos se pueden abrir en Excel, donde la salida de datos se puede organizar y convertir en las pantallas gráficas deseadas. La organización de datos en Excel permite la visualización gráfica de la salida MDV. Este gráfico muestra una visión general de la expresión diferencial de subconjuntos funcionales únicos de genes que se ven afectados por la combinación de almidón y sacarosa en distintas etapas del desarrollo de la biopelícula.

Las influencias sobre el transcriptoma de los mutantes S son más pronunciadas a las 30 horas de desarrollo de la biopelícula que en otros puntos temporales. El resultado nos ayudó a identificar con precisión subconjuntos funcionales específicos de genes que son relevantes para nuestra hipótesis de trabajo, teniendo en cuenta los efectos temporales que facilitaron la selección de genes y el posterior proceso de validación. Siguiendo este procedimiento, también se pueden realizar métodos bioquímicos y proteómicos para responder preguntas adicionales, como cuáles son las respuestas fisiológicas y metabólicas específicas de los organismos dentro de las biopelículas.

Un análisis tan exhaustivo e integrado ayudaría sin duda a comprender mejor cómo las biopelículas modulan la patogenicidad en la cavidad interior, un entorno altamente dinámico y complejo. Para obtener más detalles, consulte el archivo PDF adjunto a este artículo de video.