Name: Una analítica Caja de Herramientas para la Evaluación Integral de bioquímica, estructural y transcriptoma de biopelículas oral mediada por Streptococcus mutans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Aprenda a analizar biopelículas orales mediadas por Streptococcus mutans mediante una caja de herramientas analítica integrada que combina imagen confocal y software personalizado para estudiar su estructura y transcriptoma.

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Los autores desean agradecer al Dr. Gary Herbert Xie Lee y para el desarrollo de MDV. También queremos agradecer a los Dres. Simone Duarte, Murata Ramiro, Jeon Jae-Gyu, Abranches Jacqueline, y la Sra. Stacy Gregoire por su contribución científica y técnica de los componentes de análisis de la caja de herramientas. Este estudio fue apoyado en parte por la Beca de investigación USPHS DE018023 del Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial.

<ol><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+a+common+cause+of+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+the+matrix+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).</li>
<li>Leme, P. aes, Koo, A. F., Bellato, H., Bedi, C. M., G, J. A. C. ury <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+sucrose+in+cariogenic+dental+biofilm+formation--new+insight%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">The role of sucrose in cariogenic dental biofilm formation--new insight.</a> J Dent Res. 85, 878-887 (2006).</li>
<li>Koo, H., Schobel, B. D., Scott-Annem, K., Watson, G., Bowen, W. H., Cury, J. A., Rosalen, P. L., Park, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apigenin+and+tt-farnesol+with+fluoride+effects+on+S.+mutans+biofilms+and+dental+caries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Apigenin and tt-farnesol with fluoride effects on S. mutans biofilms and dental caries.</a> J Dent Res. 84, 1016-1020 (2005).</li>
<li>Koo, H., Xiao, J., Klein, M. I., Jeon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exopolysaccharides+produced+by+Streptococcus+mutans+glucosyltransferases+modulate+the+establishment+of+microcolonies+within+multispecies+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Exopolysaccharides produced by Streptococcus mutans glucosyltransferases modulate the establishment of microcolonies within multispecies biofilms.</a> J Bacteriol. 192, 3024-3032 (2010).</li>
<li>Jeon, J. G., Klein, M. I., Xiao, J., Gregoire, S., Rosalen, P. L., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influences+of+naturally+occurring+agents+in+combination+with+fluoride+on+gene+expression+and+structural+organization+of+Streptococcus+mutans+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influences of naturally occurring agents in combination with fluoride on gene expression and structural organization of Streptococcus mutans in biofilms.</a> BMC Microbiol. 9, 228-228 (2009).</li>
<li>Klein, M. I., DeBaz, L., Agidi, S., Lee, H., Xie, G., Lin, A. H. M., Hamaker, B. R., Lemos, J. A., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Streptococcus+mutans+transcriptome+in+response+to+starch+and+sucrose+during+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Streptococcus mutans transcriptome in response to starch and sucrose during biofilm development.</a> PLoS ONE. , 0013478-0013478 (2010).</li>
<li>Lemos, J. A., Abranches, J., Koo, H., Marquis, R. E., Burne, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+Study+the+Physiology+of+Oral+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Protocols to Study the Physiology of Oral Biofilms.</a> Methods Mol Biol. 666, 87-102 (2010).</li>
<li>Koo, H., Hayacibara, M. F., Schobel, B. D., Cury, J. A., Rosalen, P. L., Park, Y. K., Vacca-Smith, A. M., Bowen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Streptococcus+mutans+biofilm+accumulation+and+polysaccharide+production+by+apigenin+and+tt-farnesol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Streptococcus mutans biofilm accumulation and polysaccharide production by apigenin and tt-farnesol.</a> J Antimicrob Chemother. 52, 782-789 (2003).</li>
<li>Koo, H., Seils, J., Abranches, J., Burne, R. A., Bowen, W. H., Quivey, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+apigenin+on+gtf+gene+expression+in+Streptococcus+mutans+UA159%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Influence of apigenin on gtf gene expression in Streptococcus mutans UA159.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 50, 542-546 (2006).</li>
<li>Klein, M. I., Duarte, S., Xiao, J., Mitra, S., Foster, T. H., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+basis+of+the+role+of+starch+and+sucrose+in+Streptococcus+mutans+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular basis of the role of starch and sucrose in Streptococcus mutans biofilm development.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 837-841 (2009).</li>
<li>Cury, J. A., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+purification+of+total+RNA+from+Streptococcus+mutans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Extraction and purification of total RNA from Streptococcus mutans biofilms.</a> Anal Biochem. 365, 208-214 (2007).</li>
<li>Xiao, J., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+organization+and+dynamics+of+exopolysaccharide+matrix+and+microcolonies+formation+by+Streptococcus+mutans+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structural organization and dynamics of exopolysaccharide matrix and microcolonies formation by Streptococcus mutans in biofilms.</a> J Appl Microbiol. 108, 2103-2113 (2010).</li>
<li>Thurnheer, T., Gmür, R., Shapiro, S., Guggenheim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+transport+of+macromolecules+within+an+in+vitro+model+of+supragingival+plaque%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mass transport of macromolecules within an in vitro model of supragingival plaque.</a> Appl Environ Microbiol. 69, 1702-1709 (2003).</li>
<li>Chalmers, N. I., Palmer, R. J. J. r, Du-Thumm, L., Sullivan, R., Shi, W., Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantum+dot+luminescent+probes+to+achieve+single-cell+resolution+of+human+oral+bacteria+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms.</a> Appl Environ Microbiol. 73, 630-636 (2007).</li>
<li>Deng, D. M., Hoogenkamp, M. A., Ten Cate, J. M. >, Crielaard, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+metabolic+activity+indicator+in+Streptococcus+mutans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Novel metabolic activity indicator in Streptococcus mutans biofilms.</a> J Microbiol Methods. 77, 67-71 (2009).</li>
</ol>

En esta presentación, hemos demostrado dos componentes fundamentales de la caja de herramientas analíticas (EPS / bacterias de imágenes y datos de microarrays de minería / procesamiento), la versatilidad y utilidad de los diversos análisis integrado en el sistema. Claramente, la caja de herramientas facilita el análisis integral (comparativa) y simultánea de los distintos aspectos de la bioquímica de las biopelículas, la arquitectura y la expresión génica en respuesta a las diferentes condiciones experimentales utilizan...

<table><tbody><tr><td>Syto 9</td><td>Invitrogen</td><td>S34854</td><td></td></tr><tr><td>Syto 60</td><td>Invitrogen</td><td>S11342</td><td></td></tr><tr><td>Dextrano conjugado con alexa 647</td><td>Invitrogen</td><td>D22914</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de barrido láser de dos fotones Olympus FV1000</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

una analítica caja de herramientas para la evaluación integral de bioquímica, estructural y transcriptoma de biopelículas oral mediada por streptococcus mutans

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Los biofilms son muy dinámicos, las comunidades organizadas y estructuradas de las células microbianas inmersos en una matriz extracelular de la densidad y la composición variable de 1, 2. En general, los biofilms se desarrollan a partir fijación microbiana inicial sobre una superficie seguido por la formación de grupos de células (o microcolonias) y el desarrollo y la estabilización de las microcolonias, que se producen en una matriz extracelular complejo. La mayoría de los exopolisacáridos del biofilm matrices puerto (EPS), y las biopelículas dentales no son una excepción, especialmente los relacionados con la enfermedad de caries, que son en su mayoría mediada por estreptococos mutans 3. Las EPS son sintetizadas por los microorganismos (S. mutans, un contribuyente clave) por medio de enzimas extracelulares, tales como la sacarosa principalmente glucosiltransferasas utilizando como sustrato 3. Estudios de biofilms formados en la superficie de los dientes son particularmente difíciles debido a su exposición constante a los problemas ambientales asociados con la dieta compleja microbiana de acogida interacciones que ocurren en la cavidad oral. Una mejor comprensión de los cambios dinámicos de la organización estructural y composición de la matriz, la fisiología y transcriptoma / profile proteoma del biofilm las células en respuesta a las complejas interacciones permitirían mejorar el conocimiento actual de cómo los biofilms orales modular patogenicidad. Por lo tanto, hemos desarrollado una caja de herramientas analíticas para facilitar el análisis del biofilm en los planos estructurales, bioquímicos y moleculares mediante la combinación de las técnicas comúnmente disponibles y la novela con hechos a medida de software para análisis de datos. Estándar de análisis (ensayos colorimétricos, RT qPCR y microarrays) y nuevas técnicas de fluorescencia (para el etiquetado simultánea de bacterias y EPS) se han integrado con un software específico para el análisis de datos para hacer frente a la compleja naturaleza de la investigación biofilm oral. La caja de herramientas se compone de 4 pasos distintos pero conectados entre sí (Figura 1): 1) Los bioensayos, 2) datos primarios de entrada, 3) Procesamiento de Datos, y 4) Análisis de datos. Hemos utilizado nuestro modelo in vitro de biopelículas y condiciones experimentales para demostrar la utilidad y la flexibilidad de la caja de herramientas. El modelo de biofilm es simple, reproducible y múltiples repeticiones de un mismo experimento se puede hacer al mismo tiempo 4, 5. Además, permite la evaluación temporal, la inclusión de especies microbianas diversas 5 y la evaluación de los efectos de las distintas condiciones experimentales (por ejemplo, tratamientos de 6, la comparación de mutantes knockout contra la cepa parental 5; disponibilidad de hidratos de carbono 7). Aquí se describen dos componentes específicos de la caja de herramientas, incluyendo (i) un nuevo software para minería de datos de microarrays / organización (MDV) y el análisis de fluorescencia de imagen (DUOSTAT), y (ii) in situ EPS-etiquetado. También ofrecemos un caso experimental que muestra cómo la caja de herramientas puede ayudar con el análisis de biofilms, los datos de la organización, integración e interpretación.

Biofilms formados en la superficie de los dientes son muy complejas y expuestas a constantes desafíos ambientales innata y exógenos, que modulan su arquitectura, la fisiología y transcriptoma. Hemos desarrollado un conjunto de herramientas para examinar la composición, organización estructural y la expresión génica de los biofilms orales, que pueden adaptarse a otras áreas de investigación del biofilm.

Una analítica Caja de Herramientas para la Evaluación Integral de bioquímica, estructural y transcriptoma de biopelículas oral mediada por Streptococcus mutans

Los biofilms son comunidades de células microbianas altamente dinámicas, organizadas y estructuradas, envueltas en una matriz extracelular de densidad variable y...

Los biofilms formados en las superficies dentales son altamente complejos y estructurados. Comunidades microbianas atrapadas en una matriz extracelular, que están expuestas a desafíos ambientales constantes. El objetivo general aquí es mostrar dos componentes específicos de una caja de herramientas analítica diseñada para facilitar estudios estructurales y moleculares, considerando la naturaleza compleja de los biofilms orales mediante la combinación de una técnica novedosa de imagen de fluorescencia con un software personalizado para el procesamiento y análisis de datos.Esto se logra seleccionando primero ensayos específicos para el análisis de biopelículas, transcriptoma y estructura, incluyendo un nuevo enfoque de imagen confocal para la visualización simultánea de EPS y bacterias. El segundo paso del procedimiento consiste en recopilar los datos brutos provenientes de los bioensayos. El tercer paso es procesar los datos brutos utilizando software específico, incluyendo el recientemente desarrollado duo stat para el análisis de colocalización.El paso final consiste en analizar los datos del proceso, incluido el uso de software de minería y organización de datos de microarreglos,

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Inmunología e Infección

Se presenta un protocolo para el análisis estructural y de composición del biofilm oral, natural de aparatos de ortodoncia...

Análisis de biofilm oral del paladar Expansores por fluorescencia de hibridación in situ y microscopía de escaneo láser confocal

Fuente: Schlafer, S, y Frost Kristensen, M. Monitorización del pH extracelular en biofilms inter-reino mediante microscopía confocal. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demuestra el cultivo de biopelículas cruzadas de Streptococcus mutans y Candida albicans bajo condiciones similares a las orales para modelar las interacciones bacteriana-fúngica, permitiendo el estudio de la sinergia microbiana, la adhesión mediada por glucano y la virulencia acidogénica en la patogénesis oral.

Establecimiento de biopelículas bacteriana-fúngica cruzadas para el estudio de la patogénesis oral

Source: Alshehri, M. et. al., Organotypic Tissue Model Systems for Investigating Host-Pathogen Interactions In Vitro. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates a co-culture model using multi-species oral biofilms and human oral epithelium. It highlights epithelial immune activation and enables the downstream analysis of host-pathogen interaction.

A Transwell Tissue Model for Studying Interactions Between Human Oral Biofilms and Epithelium

Se presenta un protocolo para la cuantificación y comparación concurrente de tres componentes celulares y extracelulares dentro de biofilms. La metodología implica el uso de microscopía de escaneo láser confocal, software de análisis y visualización estructural de biopelículas y software de análisis estadístico.

Cuantificación concurrente de componentes celulares y extracelulares de biofilms

El objetivo de este documento métodos es describir el uso de un sistema de microfluidos para el desarrollo de biopelículas de especies múltiples que contienen especies típicamente identificados en la placa dental supragingival humano. Métodos para describir la arquitectura de biopelículas, la viabilidad de biopelículas, y un acercamiento a la cosecha biofilm para los análisis dependientes de la cultura o la cultura independiente se destacan.

El uso de un gran procesamiento<em&gt; In Vitro</em&gt; Sistema de microfluidos para el Desarrollo de biopelículas orales múltiples especies

Las infecciones por biofilm muestran una alta tolerancia a la quimioterapia. Ningún ensayo por sí solo capta la complejidad de las biopelículas. En su lugar, se necesitan ensayos complementarios. Presentamos una plataforma de cribado (desarrollada para S. aureus) que combina ensayos de viabilidad, biomasa y matriz de biopelícula. Permite el descubrimiento de fármacos anti-biopelícula, incluida la evaluación de los efectos quimioterapéuticos a largo plazo.

Una plataforma de ensayos anti-biopelícula Adecuado para la Exploración de bibliotecas de compuestos naturales

Cambios en el microbioma oral a lo largo de la infancia son de creciente interés. Comparación de microbioma diferentes estudios revela una falta de protocolos de muestreo estandarizados. Espacio limitado hace muestreo del sonido surco subgingival de niños desafiantes. Papel punto de muestreo se presenta aquí en detalle como el método de elección para esta área.

Biofilm oral toma de muestras para análisis de microbioma en niños sanos

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la formación de biofilm oral sobre materiales de titanio y zirconio para pilares de prótesis dental, incluyendo el análisis de la viabilidad de las células bacterianas y características morfológicas. Un modelo en situ asociado con técnicas de microscopía de gran alcance se utiliza para el análisis de biofilm oral.

Formación de Biofilm oral sobre diferentes materiales para implantes dentales

Los productos naturales representan prometedores puntos de partida para el desarrollo de nuevos fármacos y agentes terapéuticos. Sin embargo, debido a la alta diversidad química, encontrar nuevos compuestos terapéuticos de las plantas es una tarea difícil y que consume mucho tiempo. Describimos un enfoque simplificado para identificar moléculas antimicrobianas y antibiócidas a partir de extractos y fracciones vegetales.

Enfoque sistemático para identificar nuevas moléculas antimicrobianas y antibiócidas de extractos y fracciones de plantas para prevenir caries dentales

Este protocolo ofrece un flujo de trabajo modular BSL-2 que combina ensayos de biomasa cristal-violeta, cinética de contraste de fase en lapso de tiempo, mapeo confocal 3D/matricial, ultraestructura SEM y un módulo in vivo de infección por hámster para cultivar, cuantificar, caracterizar e investigar el papel funcional de la biopelícula de Leptospira , permitiendo la evaluación estandarizada de mutantes e intervenciones antibiofilm en laboratorios.

Un flujo de trabajo modular para el análisis cuantitativo, estructural y funcional de biopelículas de Leptospira

Aprenda a analizar biopelículas orales mediadas por Streptococcus mutans mediante una caja de herramientas analítica integrada que combina imagen confocal y software personalizado para estudiar su estructura y transcriptoma.

Una analítica Caja de Herramientas para la Evaluación Integral de bioquímica, estructural y transcriptoma de biopelículas oral mediada por Streptococcus mutans (Video) | JoVE Journal

Una analítica Caja de Herramientas para la Evaluación Integral de bioquímica, estructural y transcriptoma de biopelículas oral mediada por Streptococcus mutans

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