Recogida de concentración variable conjuntos de datos calorimetría de titulación isotérmica para determinar los mecanismos de enlace

El objetivo general de este procedimiento es identificar el modelo físico correcto que describe la unión de una macromolécula a su ligando y determinar los parámetros termodinámicos asociados. Esto se logra preparando primero una solución madre de la macromolécula a través de diálisis extensiva. A continuación, el ligando de interés se disuelve en el tampón de diálisis final y las concentraciones de todos los componentes se determinan en el segundo paso.

Las muestras de macromoléculas y ligandos se diluyen cuidadosamente hasta obtener una serie de concentraciones diferentes. A continuación, se realizan una serie de experimentos de calorimetría de titulación isotérmica, o ITC, a varias concentraciones de ligando y proteína para producir una serie de isotermas ITC en el paso final del procedimiento. El análisis global de la serie de experimentos se realiza utilizando diferentes modelos físicos y el modelo que proporciona la mejor concordancia general se identifica como correcto.

Hoy le mostraré un método que puede ayudar a responder preguntas biofísicas, como cómo las moléculas de proteínas se unen a sus ligandos y puede proporcionar medidas precisas de parámetros de unión como la entropía, la entropía y las constantes de asociación antes del inicio de este protocolo. Purifique la proteína de interés, la macromolécula utilizada en esta demostración es un inmunoglucósido N seis primos, una transferasa sutil uno I o un C seis primos uno I.To comenzar, prepare cuatro litros de tampón de diálisis y enfríe a cuatro grados centígrados. A continuación, dialice un pequeño volumen de una solución de macromolécula.

En este caso, cinco mililitros de 400 micromolares de AAC C seis cebar, un ojo en 1,3 litros de tampón de diálisis a cuatro grados centígrados. Esto se puede hacer en una cámara frigorífica o en un refrigerador con tampón fresco cada ocho horas y dializar un total de tres veces. Guarde la solución de diálisis final.

Filtrar 750 mililitros de la solución final de diálisis a través de un filtro de celulosa de 0,45 micras y almacenar a cuatro grados centígrados. Este tampón, ahora conocido como tampón de ejecución, se utilizará para enjuagues y como diluyente. Para las muestras, enjuague a fondo un filtro de jeringa de 0,2 micras con tampón corriente.

Aplique la muestra de proteína y el filtro. Recoja suavemente la muestra en un tubo cónico antes de almacenar la solución de proteína, determine la concentración de proteína con un ensayo de proteína estándar. En este caso, la concentración de proteína se mide por ABSORBENCIA a 280 nanómetros y se calcula la concentración de enzima.

Utilizando un coeficiente de extinción generado a partir del servidor proteómico EXI, almacene la proteína de manera que se maximice la estabilidad a largo plazo. AAC C six prime one eye debe almacenarse a cuatro grados centígrados, ya que no retiene la actividad después de la congelación y descongelación de la siguiente disolución del ligando y del tampón en funcionamiento. Para esta demostración, se disolvieron cuatro miligramos de acetil coenzima A en 200 microlitros de tampón corriente para hacer una solución madre de 25 milimolares.

Este ligando se puede almacenar a menos 78 grados centígrados hasta que esté listo para usar para preparar las muestras de ITC, primero, calcule la concentración de enzima para obtener un valor de C de 64 como se describe en el protocolo escrito para AAC seis primos uno I. Esto corresponde a una concentración de 192 micromolares. Prepare una solución de dos mililitros de la macromolécula a esta concentración, diluyendo la solución madre con el tampón de funcionamiento filtrado FIA settle co-enzyme a descongelación, la solución de acetal coenzima a en un baño de agua helada. Una vez que se descongela la mezcla de la coenzima acetal una solución, calcule suavemente la concentración de la solución de ligando multiplicando la concentración de la macromolécula por el número de sitios de unión multiplicado por 10.

Prepare la solución de acetil coenzima a añadiendo 80 microlitros de la coenzima ACE de 25 milimolares, una solución madre a 420 microlitros de tampón corriente y mezclando. Transfiera la solución diluida de acetil coenzima ACE a un tubo de llenado de pipeta y devuelva la solución madre de 25 milimolares restantes a menos 78 grados Celsius para su almacenamiento. Desgasifique el a C seis cebadores un ojo y una coenzima sutil, A soluciones al vacío durante cinco minutos a 19 grados Celsius, que es un grado Celsius por debajo de la temperatura de funcionamiento experimental deseada.

Para configurar la jeringa de inyección, inserte la jeringa a través de un soporte de jeringa hasta que la pinza de jeringa montada en el lugar anterior esté a la misma altura que el soporte. Pase la segunda pinza de la jeringa sobre la jeringa de inyección hasta que esté firmemente presionada contra la parte inferior del soporte de la jeringa. Apriete suavemente la abrazadera con la unidad hexagonal de bolígrafo de 0,05 pulgadas provista.

A continuación, coloque el soporte de la jeringa en el soporte de la pipeta. Deslice suavemente el inyector de pipeta en la jeringa de inyección y asegúrese de que la punta del émbolo se introduzca directamente en el orificio de la jeringa. Una vez que esté completamente insertado, atornille el collar de bloqueo del soporte de la jeringa en el inyector de pipeta.

Antes de cargar la solución de muestra de proteína de un ojo A A C SIX PRIME, utilice el sistema de lavado de células provisto con el instrumento para lavar la celda de muestra con al menos 50 mililitros de tampón corriente. Retire el tampón residual de la celda de muestra por aspiración con una jeringa de vidrio de aguja larga de 2,5 mililitros. Retire las soluciones de la aspiradora de desgasificación con una segunda aguja larga limpia y seca.

Jeringa de 2,5 mililitros. Extraiga con cuidado un mínimo de 1,8 mililitros de la muestra de proteína A a C six prime one eye en la jeringa. Tenga cuidado para evitar las burbujas de aire.

Una vez que la jeringa esté cargada con la muestra de proteína, inserte la aguja en la celda de muestra y toque suavemente la parte inferior de la celda. Levante la aguja aproximadamente un milímetro e inyecte suavemente la muestra en la celda hasta que el exceso de líquido sea visible por encima de la parte superior de la celda de la muestra. Para limpiar la celda de cualquier burbuja de aire atrapada, levante la aguja aproximadamente un centímetro mientras se asegura de que la solución permanezca en el rebosadero y retire e inyecte rápidamente aproximadamente 0,25 mililitros de la solución.

Ahora deslice suavemente la aguja hacia arriba a lo largo del lado del rebosadero. En el pocillo de muestra, la aguja golpeará una repisa. Retire todo el líquido por encima de esta repisa ya que la repisa indica la altura deseada para la solución corriente.

Para cargar la jeringa de inyección, coloque la jeringa de hinchazón de tubo de plástico en el puerto de llenado y baje la punta del émbolo hasta la parte superior del puerto de llenado. Ahora coloque el tubo de llenado de la pipeta de solución de ligando de DGAs en la parte inferior del soporte de la pipeta. Compruebe que la punta de la jeringa no toque el fondo del tubo de llenado y aspire lentamente la solución en la jeringa hasta que una pequeña cantidad entre en el tubo de la jeringa de carga.

A continuación, cierre el puerto de llenado bajando la punta del émbolo. Esto se hace haciendo clic en el botón cerrar puerto de relleno. A continuación, eliminar las burbujas de aire que puedan haber quedado atrapadas durante la carga.

Purgue y rellene haciendo clic en el botón de recarga de purga. Purgue y rellene un total de tres veces. Una vez finalizado el proceso de recarga de purga, retire el tubo de llenado del soporte de la pipeta y limpie suavemente la punta de la jeringa con papel de seda de laboratorio.

Ahora baje la jeringa del conjunto de pipetas en la muestra. Bueno, tenga cuidado y proceda lentamente, ya que la aguja puede doblarse fácilmente. Asegúrese de que la jeringa esté completamente insertada presionando hacia abajo la base del collar de bloqueo.

Una vez que la jeringa esté asegurada, establezca la temperatura de funcionamiento deseada y seleccione una potencia de referencia que sea ligeramente superior al flujo de calor de inyección máximo esperado. En este ejemplo, se utilizan 20 grados centígrados y 20 microcalorías por segundo como temperatura de funcionamiento y potencia de referencia, respectivamente. A continuación, programe los volúmenes de inyección y los retrasos deseados.

En este caso, se utilizan 28 inyecciones, la primera con un volumen de dos microlitros y un retardo de 62 y las inyecciones posteriores con un volumen de 10 microlitros con retardo de 332. El experimento que se muestra aquí proporciona la base para generar un conjunto de datos a una sola concentración para generar las curvas adicionales necesarias. Repita este proceso con concentraciones decrecientes de macromoléculas y ligandos.

Asegúrese de que todas las muestras de macromoléculas y ligandos se originen en la misma solución madre para minimizar el error en las concentraciones. Aquí se muestra la traza de calorimetría de titulación isotérmica cruda producida a partir de la titulación de 3,86 milimolares ligando acetil coenzima A en 192 micromolares de la micromolécula. A A C seis primos uno.

Se utilizaron valores integrados a ojo para determinar los parámetros de unión con un ajuste secuencial de dos sitios. Este gráfico muestra las isotermas generadas por ITC de concentraciones variadas de ACE Coenzima A y AAC C seis Prime One Eye. Los datos experimentales representados por círculos abiertos se ajustaron tanto a un modelo independiente de dos conjuntos de sitios como a un modelo secuencial de dos sitios.

Se observa una mejor concordancia con el modelo secuencial de dos sitios. Las concentraciones de proteínas utilizadas se definen en el texto adjunto. Al realizar este procedimiento, es importante ser muy preciso con su dilución, ya que el cambio en las concentraciones puede tener un impacto drástico en sus resultados.