Recogida de concentración variable conjuntos de datos calorimetría de titulación isotérmica para determinar los mecanismos de enlace

El objetivo general de este procedimiento es identificar el modelo físico correcto que describa la unión de una macromolécula a su ligando y determinar los parámetros termodinámicos asociados. Esto se logra primero preparando una solución stock de la macromolécula mediante diálisis extensiva. Luego, el ligando de interés se disuelve en el tampón final de diálisis y en una segunda etapa se determinan las concentraciones de todos los componentes.

Las muestras de macromoléculas y ligandos se diluyen cuidadosamente a una serie de concentraciones diferentes. A continuación, se realizan una serie de experimentos de calorimetría de titulación isotérmica, o ITC, a varias concentraciones tanto del ligando como de la proteína, para producir una serie de isotermas de ITC en la etapa final del procedimiento. Se realiza un análisis global de la serie de experimentos utilizando diferentes modelos físicos y se identifica como correcto el modelo que proporciona el mejor acuerdo general.

Hoy les mostraré un método que puede ayudar a responder preguntas biofísicas, como la forma en que las moléculas proteicas se unen a sus ligandos, y que puede proporcionar medidas precisas de parámetros de unión tales como entropía, entalpía y constantes de asociación. Antes de comenzar este protocolo, purifique la proteína de interés. La macromolécula utilizada en esta demostración es una inmunoglucosidasa N seis prima, una transferasa de subtiles uno I o una C seis prima uno I. Para empezar, prepare cuatro litros de tampón de diálisis y enfríe a cuatro grados Celsius. A continuación, diализar un pequeño volumen de una solución de macromolécula.

En este caso, cinco mililitros de AAC C seis prima 400 micromolar, un ojo en 1.3 litros de tampón de diálisis a cuatro grados Celsius. Esto puede hacerse en una cámara frigorífica o en un refrigerador, intercambiando con tampón fresco cada ocho horas y realizando la diálisis un total de tres veces. Guarde la solución final de diálisis.

Filtre 750 mililitros de la solución final de diálisis a través de un filtro de celulosa de 0,45 micrones y almacénelo a cuatro grados Celsius. Este tampón, denominado ahora tampón de funcionamiento, se utilizará para los lavados y como diluyente. Para las muestras, lave cuidadosamente un filtro de jeringa de 0,2 micrones con el tampón de funcionamiento.

Aplique la muestra de proteína y filtre. Recopile suavemente la muestra en un tubo cónico antes de almacenar la solución de proteína y determine la concentración de proteína mediante un ensayo estándar de proteínas. En este caso, la concentración de proteína se mide por ABSORBENCIA a 280 nanómetros y se calcula la concentración de enzima.

Utilizando un coeficiente de extinción generado a partir del servidor proteómico EXI, almacene la proteína de manera que se maximice su estabilidad a largo plazo. AAC C seis prime uno eye debe almacenarse a cuatro grados Celsius, ya que no conserva la actividad tras los ciclos de congelación y descongelación. A continuación, disuelva el ligando y el tampón de corrida. Para esta demostración, se disolvieron cuatro miligramos de acetil coenzima A en 200 microlitros de tampón de corrida para obtener una solución stock de 25 milimolar.

Este ligando puede almacenarse a menos 78 grados Celsius hasta que esté listo para usar en la preparación de las muestras de CIT; primero, calcule la concentración de enzima para obtener un valor C de 64, como se describe en el protocolo escrito para AAC seis prima uno I. Esto corresponde a una concentración de 192 micromolar. Prepare una solución de dos mililitros del macromolécula a esta concentración, diluyendo la solución stock con el tampón de trabajo filtrado. Desele el coenzima A, la solución de acetil coenzima A en un baño de hielo y agua. Una vez descongelada la solución de acetil coenzima A, mezcle suavemente y calcule la concentración de la solución de ligando multiplicando la concentración del macromolécula por el número de sitios de unión multiplicado por 10.

Prepare la solución de acetil coenzima A añadiendo 80 microlitros de la coenzima ACE 25 milimolar, una solución madre, a 420 microlitros de tampón de corrida y mezclando. Transfiera la solución diluida de acetil coenzima ACE a un tubo de llenado para pipeta y devuelva la solución madre restante de 25 milimolar a menos 78 grados Celsius para su almacenamiento. Desgasifique las soluciones de a C seis prima uno ojo y de coenzima A bajo vacío durante cinco minutos a 19 grados Celsius, lo cual es un grado Celsius por debajo de la temperatura deseada de corrida experimental.

Para preparar la jeringa de inyección, inserte la jeringa a través del soporte de jeringa hasta que la abrazadera para jeringa premontada esté a la misma altura que el soporte. Pase la segunda abrazadera para jeringa sobre la jeringa de inyección hasta que quede firmemente presionada contra la parte inferior del soporte de jeringa. Ajuste suavemente la abrazadera con la llave hexagonal de bola de 0,05 pulgadas proporcionada.

A continuación, coloque el soporte de la jeringa en el soporte para pipetas. Deslice suavemente el inyector de pipeta dentro de la jeringa de inyección y asegúrese de que la punta del émbolo entre directamente en el orificio de la jeringa. Una vez insertado completamente, enrosque el collar de bloqueo del soporte de la jeringa en el inyector de pipeta.

Antes de cargar la solución de la muestra de la proteína A a C seis prime uno ojo, utilice el sistema de lavado de celda proporcionado con el instrumento para lavar la celda de muestra con al menos 50 mililitros de tampón de corrida. Retire el tampón residual de la celda de muestra mediante aspiración con una jeringa de vidrio de 2,5 mililitros con aguja larga. Retire las soluciones del vacío de desgasificación utilizando una segunda aguja larga limpia y seca.

Jeringa de 2.5 mililitros. Aspire cuidadosamente un mínimo de 1.8 mililitros de la muestra de proteína A a C seis prime uno ojo en la jeringa. Tenga cuidado para evitar burbujas de aire.

Una vez que la jeringa esté cargada con la muestra de proteína, inserte la aguja en la celda de muestra y toque suavemente el fondo de la celda. Eleve la aguja aproximadamente un milímetro e inyecte suavemente la muestra en la celda hasta que se observe líquido en exceso por encima del borde superior de la celda de muestra. Para eliminar cualquier burbuja de aire atrapada en la celda, eleve la aguja aproximadamente un centímetro asegurándose de que permanezca solución en el desbordamiento, y retire y vuelva a inyectar rápidamente aproximadamente 0,25 mililitros de la solución.

Ahora deslice suavemente la aguja hacia arriba a lo largo del costado del rebosadero. En el pozo de muestra, la aguja tocará un saliente. Retire todo el líquido por encima de este saliente, ya que este indica la altura deseada para la solución de corrida.

Para cargar la jeringa de inyección, coloque la jeringa de hinchado de tubo plástico en el puerto de llenado y baje la punta del émbolo hasta la parte superior del puerto de llenado. Coloque ahora el tubo de llenado de pipeta con la solución del ligando DGA en el fondo del soporte para pipetas. Verifique que la punta de la jeringa no toque el fondo del tubo de llenado y aspire lentamente la solución hacia la jeringa hasta que una pequeña cantidad entre en el tubo de la jeringa de carga.

A continuación, cierre el puerto de llenado bajando la punta del émbolo. Esto se realiza haciendo clic en el botón de cierre del puerto de llenado. Luego, elimine cualquier burbuja de aire que pudiera haber quedado atrapada durante la carga.

Purgue y rellene haciendo clic en el botón de purga y relleno. Realice el proceso de purga y relleno un total de tres veces. Una vez completado el proceso de purga y relleno, retire el tubo de llenado del soporte de pipeta y limpie suavemente la punta de la jeringa con papel absorbente de laboratorio.

Ahora baje la jeringa del ensamblaje de la pipeta hacia la muestra. Tenga cuidado y proceda lentamente, ya que la aguja puede doblarse fácilmente. Asegúrese de que la jeringa esté completamente insertada presionando hacia abajo la base del collar de bloqueo.

Una vez asegurada la jeringa, establezca la temperatura de funcionamiento deseada y seleccione una potencia de referencia ligeramente mayor que el flujo de calor máximo por inyección esperado. En este ejemplo, se utilizan 20 grados Celsius y 20 microcalorías por segundo como temperatura de funcionamiento y potencia de referencia, respectivamente. Luego programe los volúmenes de inyección y los retrasos deseados.

Aquí se utilizan 28 inyecciones, siendo el primero con un volumen de dos microlitros y un retardo de 62 segundos, y las inyecciones subsiguientes con un volumen de 10 microlitros y retardos de 332 segundos. El experimento demostrado aquí proporciona la base para generar un conjunto de datos a una sola concentración con el fin de obtener las curvas adicionales necesarias. Repita este proceso con concentraciones decrecientes de macromolécula y ligando.

Asegúrese de que todas las muestras de macromoléculas y ligandos provengan de la misma solución stock para minimizar el error en las concentraciones. Aquí se muestra el trazo crudo de calorimetría de titulación isotérmica obtenido a partir de la titulación de ligando acetil coenzima A 3,86 milimolar en 192 micromolar de la micromolécula. A A C seis prima uno.

Se utilizaron los valores integrados del ojo para determinar los parámetros de unión mediante un ajuste secuencial de dos sitios. Este gráfico muestra las isotermas generadas por calorimetría isotérmica de titulación (ITC) con concentraciones variables de Coenzima A de ACE y AAC C seis Prime One Eye. Los datos experimentales representados por círculos abiertos se ajustaron tanto a un modelo independiente de dos conjuntos de sitios como a un modelo secuencial de dos sitios.

Se observa una mejor concordancia con el modelo secuencial de dos sitios. Las concentraciones de proteína utilizadas se definen en el texto adjunto. Al realizar este procedimiento, es importante ser muy preciso con la dilución, ya que el cambio en las concentraciones puede tener un impacto drástico en los resultados.