El uso de un ensayo de microarrays Pan-viral (Virochip) a la pantalla de muestras clínicas de los patógenos virales

Este procedimiento utiliza el chip Viro, un ensayo de microarrays panviral para analizar muestras clínicas de virus conocidos y desconocidos. Los primeros ácidos nucleicos se extraen de muestras clínicas. A continuación, el ARN extraído se transcribe invertido utilizando cebadores aleatorios.

Se realiza la síntesis de CD NA de segunda cadena y se amplifica la biblioteca de CD NA con PCR aleatoria. A continuación, el cd NA amplificado se marca con tintes fluorescentes y se hibrida en un microarray de chips virales. El paso final es escanear y analizar el microarray.

En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la presencia o ausencia de un virus o varios virus a través del análisis del microarray del chip. Los métodos de detección de amplio espectro, como un microarray de chips virales, son necesarios en la microbiología diagnóstica porque los síndromes clínicos comunes, como la neumonía, no son específicos de ningún patógeno individual, y debido a la continua amenaza emergente de nuevos patógenos virales como el coronavirus SARS y el nuevo virus de la influenza H one N one one 2009. Por ejemplo, qué porcentaje de infecciones no diagnosticadas en el entorno clínico pueden ser causadas por nuevos virus aún no identificados. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia un mejor diagnóstico de la enfermedad clínica aguda en el hospital, ya que estamos analizando cientos o miles de patógenos potenciales simultáneamente.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue en 2002, cuando decidimos aplicar la tecnología recién desarrollada de microarrays, iniciada en el laboratorio del Dr. Joseph DeRisi en la UCSF, a la detección de virus. Nuestro primer caso de prueba en el mundo real fue el uso del chip viral para identificar un nuevo coronavirus responsable del SARS en 2003, demostrando el procedimiento de principio a fin será un técnico de mi laboratorio que demostrará el uso del ensayo del chip viral en una muestra de hisopo nasal de un niño para diagnosticar la causa de su enfermedad respiratoria aguda. Las muestras de hisopos nasofaríngeos se recogen en recipientes estériles que contienen transporte viral, medios líquidos y se almacenan congelados en un congelador a menos 80 grados centígrados.

En una capucha de bioseguridad, deje que el tubo que contiene la muestra se descongele y revuelva brevemente el hisopo en el medio antes de desechar el hisopo en un contenedor de cintura de riesgo biológico. A continuación, alícuota 200 microlitros de la muestra en un tubo de 1,5 mililitros. Pase la muestra a través de un filtro de centrifugado de 0,22 micras para purificarla en busca de partículas virales y en un tubo nuevo de 1,5 mililitros.

A continuación, utilice el kit Turbo DNA de Ambien según las instrucciones del fabricante para degradar el ADN genómico del huésped y purificarlo para obtener ácido nucleico viral encapsulado protegido. Siga esto con la extracción de ARN, utilizando el kit de extracción de ARN viral XMO ZR o el kit de virus de ultrasonido Qiagen según las instrucciones del fabricante. Mida la concentración del ARN extraído con un espectrofotómetro de ácido nucleico NanoDrop.

La concentración de ARN es preferiblemente de al menos 10 nanogramos por microlitro, pero variará de una muestra a otra utilizando un tubo de pared delgada de 200 microlitros. Agregue un microlitro de cebador A a una concentración de 40 moles PICA por microlitro a cuatro microlitros de ARN extraído. Caliente la muestra a 65 grados centígrados durante cinco minutos en un termociclador y luego deje que el tubo se enfríe a temperatura ambiente durante cinco minutos.

A continuación, agregue cinco microlitros de una mezcla maestra que contenga dos microlitros cinco veces RT tampón, un microlitro de 12,5 milimolar, DNTP un microlitro de agua de 0,5 microlitros, 0,1 molar DTT y 0,5 microlitros superíndice de tres transcriptasa inversa en un termociclador. Incuba el tubo a 42 grados centígrados durante 60 minutos. A continuación, caliente la muestra a 94 grados centígrados durante dos minutos.

Para abortar la reacción de transcriptasa inversa, llame a 10 grados Celsius durante dos minutos y centrifuga por pulso durante cinco segundos. A continuación, agregue cinco microlitros de mezcla de queasa que consta de un microlitro cinco veces tampón de queasa, 3,8 microlitros de agua y 0,15 microlitros de queasa la síntesis de la segunda hebra. Aumente el termociclador de 10 grados Celsius a 37 grados Celsius durante ocho minutos.

Mantenga la posición a 37 grados centígrados durante ocho minutos. Luego caliente a 94 grados centígrados durante dos minutos para inactivar la reina y llamar a 10 grados centígrados en este punto. Si lo desea, almacene la muestra que contiene 15 microlitros de CDNA a menos 20 grados centígrados.

Primero, agregue cinco microlitros de muestra de CD NA a 45 microlitros de una mezcla maestra que consta de cinco microlitros 10 veces tampón PCR, un microlitro 12.5 milimolar, DNTP un microlitro 100 pomo por cebador de microlitro, B un microlitro cleantech LA y 37 microlitros de agua. A continuación, ejecute el protocolo de PCR de la siguiente manera, 94 grados centígrados durante dos minutos, seguido de 25 ciclos de 94 grados centígrados durante 30 segundos. 50 grados centígrados durante 45 segundos y 72 grados centígrados durante un minuto.

A continuación, un paso de rodillas de 72 grados centígrados durante cinco minutos, seguido de una retención a 10 grados centígrados después de la PCR. Compruebe el producto PCR y un gel de electroforesis al 1,5%AOSE. Se debe visualizar un frotis de aproximadamente 200 a 1000 pares de bases.

Para incorporar AAD DNTP, agregue cinco microlitros de producto de PCR viral a 45 microlitros de una mezcla maestra que consta de cinco microlitros 10 veces tampón PCR, un microlitro de 12,5 milimolar, A-A-D-N-T-P un microlitro 100 p de cebador de microlitros múltiples, B un microlitro ClinTech LA y 37 microlitros de agua. Ejecute el protocolo PCR de la siguiente manera, 94 grados centígrados durante dos minutos, 15 ciclos de 94 grados centígrados durante 30 segundos. 50 grados centígrados durante 45 segundos.

72 grados centígrados durante un minuto y un paso de rodillas de 72 grados centígrados durante cinco minutos y mantener a 10 grados centígrados. A continuación, limpie el nuevo producto de PCR con el kit de limpieza y concentrador de ADN tres según las instrucciones del fabricante y agregue 10 microlitros de tampón de elución. Añadir un microlitro de un molar de bicarbonato y un microlitro de tres a los 10 microlitros de producto PCR e incubar durante una hora en la oscuridad.

A continuación, de nuevo, limpie la muestra marcada con la etiqueta S con el kit de limpieza de ADN y concentrador de cinco y eluya en 12 microlitros de tampón de elución. Utilice 1,5 microlitros de muestra para comprobar la concentración de CDNA y la cantidad de colorante incorporado en un espectrofotómetro NanoDrop en un tubo de tira de PCR a un microlitro 25 veces tampón de fragmentación, cinco microlitros, cinco veces tampón de bloqueo, 9,5 microlitros o la cantidad necesaria para una concentración final normalizada de 10 picos, o moles por microlitro de SI, tres muestras marcadas y agua hasta un volumen total de 25 microlitros. A continuación, añada 25 microlitros de tampón de hibridación dos veces GX y gire brevemente para eliminar las burbujas.

Coloque una nueva corredera de junta en la cámara de hibridación. Cargue 40 microlitros de la muestra en el portaobjetos de la junta. A continuación, coloque la matriz viral impresa de Agilent con el lado marcado como Agilent hacia abajo en la parte superior de la corredera de la junta y apriete el tornillo firmemente.

Coloque la cámara de hibridación en un horno a 65 grados centígrados y hibrida durante la noche utilizando una rotación lenta de 10 rotaciones por minuto para lavar las matrices. Primero precaliente el tampón de dos a 37 grados centígrados mientras calienta. Llene un recipiente de plástico de 500 mililitros con aproximadamente 250 mililitros de tampón. Uno.

Retire la matriz de la cámara de hibridación, sumerja la matriz y sepárela de la corredera de la junta. Transfiera la matriz al recipiente limpio y lávela en tampón uno durante un minuto. Luego, use un recipiente de plástico separado de 500 mililitros.

Lave la matriz en el tampón precalentado dos durante un minuto. Después del lavado, retire lentamente la matriz del búfer. Dos, tener cuidado de evitar las burbujas.

Use una toallita kim para absorber el exceso de humedad y tenga cuidado de evitar tocar directamente el lado activo de la matriz. Por último, coloque la diapositiva en el soporte de portaobjetos con el lado Agilent hacia arriba e insértela en el escáner de matriz. En este procedimiento, utilizamos un escáner de microarrays de ADN de dos micras de Agilent.

Escanee la matriz SI de tres marcas a cinco micras o dos micras de acuerdo con el protocolo de escaneo estándar del instrumento. Analice microarrays de chips virales mediante análisis de clústeres o el programa automatizado de análisis de chips de ósmosis inversa e unpredic. Con el microarray Viro Chipp 2009, el nuevo virus de la influenza H one N one se detecta fácilmente en la muestra de hisopo nasal obtenida de un niño con una enfermedad similar a la influenza.

Además, hemos demostrado que el chip viral es capaz de identificar no solo virus respiratorios, sino también una amplia gama de virus de una variedad de tejidos y fluidos corporales diferentes. Algunos ejemplos de detección de virus en sangre total y suero utilizando el vichi como se muestra aquí. Estas son llamadas que corresponden a la microrradiación del chip viro de muestras de sangre, ya sea sangre completa o suero tomado de cuatro pacientes para cada muestra, se muestran las dos predicciones de virus principales con la predicción de virus superior que tiene el valor de P más bajo.

Por ejemplo, en la muestra resaltada en azul claro, la predicción principal para esa muestra es el virus del dengue tipo uno. Si bien la segunda predicción clasificada es el virus del dengue tipo dos, se confirmó que el virus real en esa muestra de sangre total era el virus del dengue tipo uno de acuerdo con los resultados del dict. Otra aplicación del chip viro es el descubrimiento de nuevos patógenos.

Algunos ejemplos incluyen los descubrimientos del coronavirus X-M-R-V-A, el retrovirus OME relacionado con el cáncer de próstata y el síndrome de fatiga crónica en humanos y el HTCV, un nuevo virus cardiovascular humano asociado con infecciones respiratorias y diarreicas en niños una vez dominado. Esta técnica se puede realizar en 12 horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe asegurarse de que hay que asegurarse de que dispone de todo el equipo y los reactivos necesarios siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como la amplificación específica por PCR viral y la secuenciación profunda, para confirmar y hacer un seguimiento de patrones inusuales de hibridación de chips virales o resultados de chips virales que sugieren la presencia de un nuevo virus después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la oncología exploraran la asociación de nuevos virus con el cáncer en los campos de la biodefensa y la microbiología clínica para desarrollar ensayos condensados de base micro para el diagnóstico rápido de patógenos, y en el campo de la virología para la caracterización de nuevos virus y su asociación con la enfermedad. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar todos los pasos del ensayo de microrayos del chip viral, una prueba de vigilancia de amplio espectro para detectar patógenos virales en muestras clínicas, desde la extracción de ácidos nucleicos, desde las muestras clínicas hasta la hibridación y el análisis de microrayos.

No olvide que el trabajo con muestras clínicas se considera biopeligroso y la extracción de ácidos nucleicos debe realizarse en laboratorios calificados con un nivel de bioseguridad dos o superior.