El uso de un ensayo de microarrays Pan-viral (Virochip) a la pantalla de muestras clínicas de los patógenos virales

Este procedimiento utiliza el Viro chip, un ensayo de microarreglo panviral para analizar muestras clínicas en busca de virus conocidos y desconocidos. Primero, se extraen ácidos nucleicos de las muestras clínicas. A continuación, el ARN extraído se transcribe inversamente utilizando cebadores aleatorios.

Se realiza la síntesis del ADN de la segunda cadena y la biblioteca de ADN se amplifica mediante PCR aleatoria. Luego, el ADN amplificado se marca con colorantes fluorescentes y se hibrida en un microarreglo de chip viral. El paso final consiste en escanear y analizar el microarreglo.

En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la presencia o ausencia de un virus o de varios virus mediante el análisis del microarreglo de la tarjeta. Se necesitan métodos de detección de amplio espectro, como el microarreglo de tarjeta viral, en microbiología diagnóstica porque los síndromes clínicos comunes, como la neumonía, no son específicos de ningún patógeno individual, y debido a la amenaza constante de nuevos patógenos virales emergentes, tales como el coronavirus del SARS y el virus de la gripe H1N1 novedoso de 2009. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología diagnóstica, como qué porcentaje de infecciones sin diagnóstico en el entorno clínico podrían ser causadas por virus novedosos aún no identificados. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia un mejor diagnóstico de enfermedades clínicas agudas en el hospital, ya que estamos analizando cientos o miles de patógenos potenciales simultáneamente.

La idea original de este método surgió en 2002, cuando decidimos aplicar la tecnología recién desarrollada de microarreglos, pionera en el laboratorio del Dr. Joseph DeRisi en la UCSF, a la detección de virus. Nuestro primer caso de prueba en condiciones reales consistió en utilizar el chip viral para identificar un nuevo coronavirus responsable del SARS en 2003. A continuación se muestra el procedimiento completo, desde el inicio hasta el final, que será realizado por un técnico de mi laboratorio, quien demostrará el uso del ensayo con el chip viral en una muestra de hisopo nasal de un niño para diagnosticar la causa de su enfermedad respiratoria aguda. Las muestras de hisopo nasofaríngeo se recogen en recipientes estériles que contienen medio líquido de transporte viral y se almacenan congeladas en un congelador a menos 80 grados Celsius.

En una cabina de seguridad biológica, deje que el tubo que contiene la muestra se descongele y agite brevemente el hisopo en el medio antes de desechar el hisopo en un recipiente para residuos biopeligrosos. A continuación, alícuota 200 microlitros de la muestra en un tubo de 1,5 mililitros. Pase la muestra a través de un filtro giratorio de 0,22 micrones para purificar las partículas virales y recójala en un tubo nuevo de 1,5 mililitros.

A continuación, utilice el kit Turbo DNA de Ambien siguiendo las instrucciones del fabricante para degradar el ADN genómico del hospedador y purificar el ácido nucleico viral encapsulado protegido. A continuación, realice la extracción de ARN utilizando el kit de extracción de ARN viral XMO ZR o el kit de virus de Qiagen ultrasound siguiendo las instrucciones del fabricante. Mida la concentración del ARN extraído utilizando un espectrofotómetro de ácidos nucleicos NanoDrop.

La concentración de ARN debe ser preferiblemente de al menos 10 nanogramos por microlitro, aunque variará de muestra a muestra utilizando un tubo de pared delgada de 200 microlitros. Añada un microlitro del cebador A a una concentración de 40 picomoles por microlitro a cuatro microlitros de ARN extraído. Incube la muestra a 65 grados Celsius durante cinco minutos en un termociclador y luego deje que el tubo se enfríe a temperatura ambiente durante cinco minutos.

A continuación, agregue cinco microlitros de una mezcla maestra que contiene dos microlitros de tampón RT al cinco veces, un microlitro de dNTP 12,5 milimolar, un microlitro de agua, 0,5 microlitros de DTT 0,1 molar y 0,5 microlitros de transcriptasa inversa superscript three, en un termociclador. Incube el tubo a 42 grados Celsius durante 60 minutos. Luego, caliente la muestra a 94 grados Celsius durante dos minutos.

Para detener la reacción de transcripción inversa, incubar a 10 grados Celsius durante dos minutos y centrifugar brevemente durante cinco segundos. A continuación, añadir cinco microlitros de mezcla de queasa compuesta por un microlitro de tampón de queasa al cinco veces, 3,8 microlitros de agua y 0,15 microlitros de queasa para la síntesis de la segunda cadena. Elevar la temperatura del termociclador de 10 grados Celsius a 37 grados Celsius durante ocho minutos.

Mantenga a 37 grados Celsius durante ocho minutos. Luego caliente a 94 grados Celsius durante dos minutos para inactivar la enzima y enfriar a 10 grados Celsius en este punto. Si se desea, almacene la muestra que contiene 15 microlitros de ADNc a menos 20 grados Celsius.

Primero, agregue cinco microlitros de la muestra de ADN a 45 microlitros de una mezcla maestra que consiste en cinco microlitros de tampón de PCR 10 veces, un microlitro de dNTP 12,5 milimolar, un microlitro de cebador a 100 pmoles por microlitro, B, un microlitro de CleanTech LA y 37 microlitros de agua. Luego, realice el protocolo de PCR de la siguiente manera: 94 °C durante dos minutos, seguido de 25 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 50 °C durante 45 segundos y 72 °C durante un minuto.

Luego, un paso de elongación a 72 grados Celsius durante cinco minutos, seguido de una incubación a 10 grados Celsius tras la PCR. Verifique el producto de PCR en un gel de electroforesis de AOSE al 1,5%. Debe observarse una mancha difusa de aproximadamente 200 a 1000 pares de bases.

Para incorporar AAD DNTP, agregue cinco microlitros de producto de PCR viral a 45 microlitros de una mezcla maestra que consiste en cinco microlitros de tampón de PCR 10 veces, un microlitro de A-A-D-N-T-P 12,5 milimolar, un microlitro de cebador B a 100 p por microlitro múltiple, un microlitro de ClinTech LA y 37 microlitros de agua. Ejecute el protocolo de PCR de la siguiente manera: 94 grados Celsius durante dos minutos, 15 ciclos de 94 grados Celsius durante 30 segundos, 50 grados Celsius durante 45 segundos.

72 grados Celsius durante un minuto y un paso de extensión de 72 grados Celsius durante cinco minutos, y mantener a 10 grados Celsius. Luego, purifique el nuevo producto de PCR con el kit DNA Clean and Concentrator-3 siguiendo las instrucciones del fabricante y suspenda en 10 microlitros de tampón de elución. Añada un microlitro de bicarbonato de un molar y un microlitro de si tres al 10 microlitros de producto de PCR e incube durante una hora en la oscuridad.

A continuación, limpie nuevamente la muestra etiquetada con S utilizando el kit DNA Clean and Concentrator-5 y eluya en 12 microlitros de tampón de elución. Utilice 1,5 microlitros de muestra para verificar la concentración de ADNc y la cantidad de colorante incorporado en un espectrofotómetro NanoDrop, en un tubo tipo tira para PCR, con 1 microlitro de tampón de fragmentación 25 veces, 5 microlitros de tampón de bloqueo 5 veces, 9,5 microlitros o la cantidad necesaria para una concentración final normalizada de 10 picomoles o moles por microlitro de la muestra etiquetada con SI3 y agua hasta un volumen total de 25 microlitros. Luego, agregue 25 microlitros de tampón de hibridación GX 2 veces y centrifugue brevemente para eliminar burbujas.

Coloque un nuevo portaobjeto con junta en la cámara de hibridación. Añada 40 microlitros de la muestra sobre el portaobjeto con junta. A continuación, coloque el microarreglo viral impreso por Agilent con el lado marcado Agilent hacia abajo encima del portaobjeto con junta y apriete firmemente el tornillo.

Coloque la cámara de hibridación en un horno a 65 grados Celsius e hibride durante la noche utilizando una rotación lenta de 10 rotaciones por minuto para lavar los arreglos. Primero caliente el tampón dos a 37 grados Celsius mientras calienta. Llene un recipiente plástico de 500 mililitros con aproximadamente 250 mililitros del tampón.Uno.

Retire el microarreglo de la cámara de hibridación, sumerja el microarreglo y sepárelo de la portaobjetos con junta. Transfiera el microarreglo al recipiente limpio y lávelo en el tampón uno durante un minuto. Luego, utilizando un recipiente plástico separado de 500 mililitros.

Lave el microarreglo en el tampón dos precalentado durante un minuto. Después del lavado, retire lentamente el microarreglo del tampón dos, teniendo cuidado de evitar burbujas.

Utilice una toalla de papel para eliminar el exceso de humedad, teniendo cuidado de evitar tocar directamente el lado activo del arreglo. Finalmente, coloque el portaobjetos en el soporte con el lado Agilent hacia arriba e insértelo en el escáner de arreglos. En este procedimiento, utilizamos un escáner de microarreglos de ADN Agilent de dos micrones.

Escanea la matriz etiquetada SI tres a cinco micrones o dos micrones según el protocolo de escaneo estándar del instrumento. Analiza las micromatrices virales mediante análisis de agrupamiento o el programa automatizado de análisis de micromatrices RO e unpredic. Mediante la micromatriz Viro Chipp, el virus novedoso de la influenza H uno N uno de 2009 se detecta fácilmente en la muestra de hisopo nasal obtenida de un niño con una enfermedad similar a la influenza.

Además, hemos demostrado que el chip viral es capaz de identificar no solo virus respiratorios, sino también una amplia variedad de virus procedentes de diferentes tejidos y fluidos corporales. Algunos ejemplos de detección de virus en sangre completa y suero utilizando el vichi se muestran aquí. Estas son llamadas ere correspondientes al microrray del chip viro a partir de muestras de sangre, ya sea sangre completa o suero, tomadas de cuatro pacientes; para cada muestra, se muestran las dos primeras predicciones virales, siendo la primera predicción la que presenta el valor de p más bajo.

Por ejemplo, en la muestra resaltada en azul claro, la predicción principal para esa muestra es el virus del dengue tipo uno. Aunque la segunda predicción en orden es el virus del dengue tipo dos, se confirmó que el virus presente en esa muestra de sangre completa era efectivamente el virus del dengue tipo uno, lo cual concuerda con los resultados de dict. Otra aplicación del virochip es el descubrimiento de patógenos novedosos.

Algunos ejemplos incluyen los descubrimientos del coronavirus SARS X-M-R-V-A, el retrovirus OME relacionado con el cáncer de próstata y el síndrome de fatiga crónica en humanos y el HTCV, un nuevo virus cardíaco humano asociado con infecciones respiratorias y diarrea en niños. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 12 horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar asegurar la disponibilidad de todo el equipo y los reactivos necesarios siguiendo este protocolo.

Otros métodos, como la amplificación específica de virus mediante PCR y la secuenciación profunda, pueden realizarse para confirmar y hacer seguimiento de patrones inusuales de hibridación en el chip viral o de resultados del chip viral que sugieran la presencia de un virus novedoso tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la oncología exploraran la asociación de virus novedosos con el cáncer, en los campos de la biodefensa y la microbiología clínica para desarrollar ensayos microscópicos condensados destinados al diagnóstico rápido de patógenos, y en el campo de la virología para la caracterización de virus novedosos y su asociación con enfermedades. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo realizar todos los pasos del ensayo de micromatriz viral, una prueba de vigilancia de amplio espectro para detectar patógenos virales en muestras clínicas, desde la extracción de ácidos nucleicos a partir de muestras clínicas hasta la hibridación y análisis en micromatriz.

No olvide que trabajar con muestras clínicas se considera un riesgo biológico y que la extracción de ácidos nucleicos debe realizarse en laboratorios clasificados al nivel de bioseguridad dos o superior.