Name: El uso de un ensayo de microarrays Pan-viral (Virochip) a la pantalla de muestras clínicas de los patógenos virales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Aprende el ensayo Virochip para detectar virus conocidos y novedosos en muestras clínicas mediante microarrays pan-virales. Este método mejora el diagnóstico microbiológico en entornos hospitalarios.

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Damos las gracias a David Wang, Urisman Anatoly, Amy Kistler, Fischer Kael, Patrick Tang, y Greninger Alexander para el desarrollo inicial y la optimización del protocolo de Virochip. Este trabajo es apoyado por una subvención del NIH K08 y el Premio Descubrimiento Abbott (de CC) y el Instituto Médico Howard Hughes (a JLD).

Los pasos de la prueba Virochip incluyen (1) la extracción de ácidos nucleicos a partir de muestras clínicas, (2) transcripción inversa del ARN extraído y 2 º capítulo de la síntesis de ADNc, (3) amplificación por PCR de cDNA preparada al azar, (3) la incorporación Cy3 tinte fluorescente (4), la hibridación de materiales etiquetados para los microarrays Virochip, y (5) de exploración y el análisis (Figura 1). El protocolo se muestra a continuación demuestran el uso de la prueba Virochip en una muestra de exudado nasal de un niño con una enfermedad similar a la influenza. Secuencias de los cebadores Primer A 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N 9) -3 ' Primer B 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3 ' 1. Extracción del ácido nucleico <ol><li> La extracción de ácidos nucleicos a partir de muestras clínicas se deben realizar en el Nivel de Bioseguridad 2 (BSL-2) o más condiciones, ya que estas muestras son potencialmente infecciosas. </li><li> La muestra de exudado nasal se transporta en medio de retención viral. Alícuota de 200 l de la muestra en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml Eppendorf. </li><li> Opcional: pasar de la muestra a través de un filtro de 0,22 micras (para purificar las partículas virales) </li><li> Opcional: muestra pretratamiento con DNasa (que degradan el ADN genómico de acogida, y limpiarnos de protección, encapsulados ácido nucleico viral) utilizando el kit de Turbo DNAsa (Ambion) por las instrucciones del fabricante </li><li> Extracto de la muestra utilizando el Zymo ZR ARN viral kit de extracción o Qiagen Kit Virus Ultrasens según las instrucciones del fabricante. </li></ol> 2. Transcripción reversa y 2 º capítulo de la síntesis de ADNc ("Ronda A") <ol><li> Añadir un uL 40 pmol / l Primer A 4 uL ARN extraído. Calor a 65 ° C durante 5 minutos en un termociclador (por ejemplo, GeneAmp PCR System 9700) y luego dejar enfriar a temperatura ambiente x 5 min. </li><li> Añadir 5 l de una mezcla maestra que consta de 2 l de 5X buffer RT, 1 l 12,5 mM dNTP, 1 l de agua, 0,5 l 0,1 M TDT, y un 0,5 l RT SSIII (Invitrogen). Se incuba a 42 ° C x 60 minutos. </li><li> En un termociclador programable, el calor a 94 ° C x 2 min (para abortar la reacción de la transcriptasa inversa), se enfría a 10 ° C, se centrifuga el pulso, y luego añadir 5 Sequenase l mezcla que consiste en un búfer de l Sequenase 5X, 3,8 l de agua, y 0,15 l Sequenase (USB Corporation). Para 2 º capítulo de síntesis, la rampa encima de 10 ° C a 37 ° C durante 8 min, mantener 8 minutos, luego caliente a 94 ° C x 2 min (para inactivar Sequenase) y se enfría a 10 ° C (espera). </li><li> Opcional: Rd Una muestra de cDNA se pueden almacenar en este punto a -20 ° C. </li></ol> 3. La amplificación por PCR del ADNc azar Preparado ("Ronda B") <ol><li> Añadir 5 uL de Rd una muestra de 45 l de una mezcla maestra que consta de 5 l buffer 10X PCR, 1 l 12,5 mM dNTP, 1 l 100 pmol / l B imprimación, 1 l LA KlenTaq (Sigma), y 37 l de agua. </li><li> Ejecutar protocolo de PCR de la siguiente manera: 94 ° C, 2 min → (25 ciclos de 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 min) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( espera) </li><li> Compruebe la muestra Rd B en un gel de electroforesis de agarosa al 1,5%. Una prueba de aproximadamente 200 - 1000 pb debe ser visualizado (Figura 2A) </li></ol> 4. Incorporación Cy3 tinte fluorescente <ol><li> Opcional: otra muestra se pueden etiquetar con el colorante fluorescente Cy5 y hibridizada a los microarrays mismo. </li><li> Para incorporar aa-dNTP, añadir 5 uL de la muestra B Rd a 45 l de una mezcla maestra que consta de 5 uL buffer 10X PCR, 1 uL 12,5 mm AA-dNTP (Invitrogen), 1 uL 100 pmol / uL cartilla B, 1, 1 uL KlenTaq LA (Sigma), y 37 uL de agua. Ejecutar protocolo de PCR de la siguiente manera: 94 ° C, 2 min → (15 ciclos de 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 min) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( espera) </li><li> Limpiar la muestra Rd C con el ADN limpio y Concentrador-5 Kit (Zymo de Investigación) por las instrucciones del fabricante. Eluyen en 10 mL. </li><li> Añadir 1 l de bicarbonato 1M (Sigma) y 1 uL Cy5 (GE Healthcare) a la muestra C Rd. </li><li> Incubar x 1 hora en la oscuridad. </li><li> Limpiar la muestra Cy3 marcado con el ADN limpio y Concentrador-5 Kit (Zymo de Investigación) por las instrucciones del fabricante. Eluyen en 12 mL. </li></ol> 5. La hibridación de microarrays Virochip <ol><li> Opcional: use 1.5 l para comprobar la concentración de cDNA y la cantidad de colorante incorporado en un espectrofotómetro Nanodrop (para la normalización de las muestras) </li><li> En un tubo de strip PCR añadir un buffer l fragmentación 25X, 5 l 5X buffer de bloqueo, 9,5 l (o la cantidad de normalizar) de Cy3 marcado de la muestra, y el agua hasta un volumen total de 25 l (Agilent) </li><li> Añadir 25 l de tampón de hibridación 2X Gex (Agilent). Centrifugar brevemente para eliminar las burbujas. </li><li> Carga de 40 l de la muestra de diapositivas en la junta. </li><li> Lugar Agilent impreso Virochip array (Universidad de Californiuna, San Francisco / Agilent) (lado marcado "Agilent" hacia abajo) en la parte superior de la diapositiva junta y apretar el tornillo con firmeza. </li><li> Hibridación noche a la mañana en el horno 65 ° C, ajuste de velocidad a 10 rpm. </li><li> Para lavar las matrices, precalentar el buffer 2 (Agilent) a 37 ° C. Desmontar la junta de diapositivas / array submarino sándwich en un buffer (Agilent). Lave en tampón 1 x 1 min. Lave en tampón precalentado 2 x 1 min. Poco a poco eliminar diapositivas de tampón 2, teniendo cuidado de evitar las burbujas (uso Kimwipe para absorber la humedad adicional, teniendo cuidado de evitar el contacto directo con el lado activo de la matriz) </li><li> Lugar de diapositivas en el soporte de diapositivas e insertar en el escáner matriz. </li></ol> 6. Virochip exploración y análisis <ol><li> Exploración Cy3 marcado matriz en 5 micras o 2 micras según el protocolo del instrumento de exploración estándar (Figura 2B). </li><li> Analizar microarrays Virochip por inspección visual, análisis de cluster, o el programa automatizado Virochip análisis, E-Predecir 11. Por cada uno de estos tres métodos, el virus de la influenza se detecta fácilmente en la muestra de exudado nasal (de un niño con enfermedad tipo influenza) (Figura 2 C) </li></ol> 7. Los resultados representativos: Cuando el protocolo se hace correctamente, una prueba debe ser visto en la electroforesis en gel de agarosa después del paso de Rd B (Figura 2). Los microarrays Virochip en la plataforma de Agilent será difícil de analizar visualmente (Figura 2B), pero si hay un virus que debe ser fácilmente identificados por inspección visual, análisis de conglomerados, y / o E-Predecir (fig. 1C). Las muestras pueden ser enriquecida con las cantidades medidas de ácido nucleico de un virus (virus del mosaico del tabaco; bacteriófago MS2) para servir como un control positivo para el ensayo. <img src="/files/ftp_upload/2536/2536fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Esquemática de Virochip procesamiento y análisis de microarrays. Extraído de ácidos nucleicos a partir de muestras clínicas son amplificado al azar, etiquetados con tintes fluorescentes, y hibridizada a los microarrays Virochip. Microarrays se escanean a una resolución de 2 micras y se analizaron mediante una variedad de herramientas computacionales, incluyendo E-Predecir. <img src="/files/ftp_upload/2536/2536fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Pasos en el ensayo de Virochip Después de la amplificación por PCR al azar, una mancha de 200 -. 1.000 pares de bases puede ser visualizado por electroforesis en gel (A) (B) Tres microarrays Virochip de los 8 conjuntos / portaobjetos de vidrio se muestran, con una pequeña región. de un microarray de soplado en el recuadro en la esquina inferior derecha. (C) automatizado de análisis de microarrays viral mediante E-Predecir revelando la presencia de virus de influenza A en la muestra clínica. La puntuación alta similitud (s = 0,55) corresponde a un p-valor que se aproxima a cero, lo que hace esta una predicción muy importante.

<ol><li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+detection+and+genotyping+of+viral+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 15687-15692 (2002).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+a+critical+respiratory+illness+caused+by+human+metapneumovirus+by+use+of+a+pan-virus+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of a critical respiratory illness caused by human metapneumovirus by use of a pan-virus microarray.</a> J Clin Microbiol. 45, 2340-2343 (2007).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+detection+of+human+parainfluenzavirus+4+infection+associated+with+respiratory+failure+in+an+immunocompetent+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Microarray detection of human parainfluenzavirus 4 infection associated with respiratory failure in an immunocompetent adult.</a> Clin Infect Dis. 43, e71-e76 (2006).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+DNA+microarrays+for+detection+of+viruses+in+acute+respiratory+tract+infections+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Utility of DNA microarrays for detection of viruses in acute respiratory tract infections in children.</a> J Pediatr. 153, 76-83 (2008).</li>
<li>Kistler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-viral+screening+of+respiratory+tract+infections+in+adults+with+and+without+asthma+reveals+unexpected+human+coronavirus+and+human+rhinovirus+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pan-viral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronavirus and human rhinovirus diversity.</a> J Infect Dis. 196, 817-825 (2007).</li>
<li>Rota, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+coronavirus+associated+with+severe+acute+respiratory+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome.</a> Science. 300, 1394-1399 (2003).</li>
<li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+discovery+and+sequence+recovery+using+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays.</a> PLoS Biol. 1, e2-e2 (2003).</li>
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<li>Kistler, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+divergent+avian+bornaviruses+from+cases+of+proventricular+dilatation+disease%3A+identification+of+a+candidate+etiologic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Recovery of divergent avian bornaviruses from cases of proventricular dilatation disease: identification of a candidate etiologic agent.</a> Virol J. 5, e25-e25 (2008).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cardioviruses+related+to+Theiler%27s+murine+encephalomyelitis+virus+in+human+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of cardioviruses related to Theiler's murine encephalomyelitis virus in human infections.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14124-14129 (2008).</li>
<li>Urisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-Predict%3A+a+computational+strategy+for+species+identification+based+on+observed+DNA+microarray+hybridization+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">E-Predict: a computational strategy for species identification based on observed DNA microarray hybridization patterns.</a> Genome Biol. 6, R78-R78 (2005).</li>
</ol>

El protocolo Virochip como se describe aquí es complejo y requiere un técnico de investigación meticulosa y especializada. La concentración correcta de los reactivos y las condiciones de PCR, el etiquetado y la hibridación son críticos. El protocolo Virochip se puede modificar fácilmente para adaptarse a un análisis de los tejidos enfermos mediante el uso de un método de extracción de tejidos, tales como TRIzol (Invitrogen) para la extracción de ácidos nucleicos. Las sondas se pueden añadir o eliminar si es necesario para obtener el espectro deseado y amplitud de la cobertura, por ejemplo, las sondas de detección de blancos no virales tales como bacterias y hongos pueden ser diseñados y agregó que &quot;en la marcha&quot;. Algunas aplicaciones de la prueba Virochip actualmente en desarrollo incluyen un amplio espectro de diagnóstico viral en el laboratorio clínico, investigación de brotes, detección pureza de las drogas y vacunas, y el descubrimiento de nuevos patógenos virales.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo / material </th><th> Nombre del reactivo / material </th></tr><tr><td> Primera </td><td> 5&#39;-GTTTCCCAGTCACGATA (N9) -3 &#39; </td></tr><tr><td> Primer B </td><td> 5&#39;-GTTTCCCAGTCACGATA-3 &#39; </td></tr><tr><td rowspan="5"> RT Master Mix (5 l) </td><td> 2 l de 5X buffer RT </td></tr><tr><td> 1 l 12,5 mM dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 l de agua </td></tr><tr><td> 0,5 l 0,1 M TDT </td></tr><tr><td> 0,5 l RT SSIII (Invitrogen) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Sequenase Mix (5 l) </td><td> Un buffer l Sequenase 5X </td></tr><tr><td> 3,8 l de agua </td></tr><tr><td> 0,15 l Sequenase (USB Corporation) </td></tr><tr><td rowspan="5"> ª B PCR Master Mix (45 l) </td><td> 5 l buffer 10X PCR </td></tr><tr><td> 1 l 12,5 mM dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 l 100 pmol / l cartilla B </td></tr><tr><td> 1 l LA KlenTaq (Sigma) </td></tr><tr><td> 37 l de agua </td></tr><tr><td rowspan="5"> º C PCR Master Mix (45 l) </td><td> Buffer 5 uL 10X PCR </td></tr><tr><td> 1 l 12,5 mM dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 l 100 pmol / l cartilla B </td></tr><tr><td> 1 l LA KlenTaq (Sigma) </td></tr><tr><td> 37 l de agua </td></tr><tr><td rowspan="4"> La hibridación de amortiguación (25 l) </td><td> Un buffer l fragmentación 25X (Agilent) </td></tr><tr><td> 5 l 5X buffer de bloqueo (Agilent) </td></tr><tr><td> 9,5 l (o la cantidad de normalizar) de Cy3 marcado de la muestra </td></tr><tr><td> Agregar agua a volumen total de 25 l </td></tr><tr><td> Agilent Virochip microarrays </td><td> permiso en espera, disponible a partir de Chiu laboratorio, UCSF </td></tr></tbody></table>

el uso de un ensayo de microarrays pan-viral (virochip) a la pantalla de muestras clínicas de los patógenos virales

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

El diagnóstico de la causa viral de muchas enfermedades infecciosas es difícil debido a la secuencia de la diversidad inherente a los virus, así como la aparición continua de nuevos patógenos virales, como el coronavirus del SRAS y 2009, la pandemia del virus H1N1 de la gripe, que no son detectables por los métodos tradicionales. Para enfrentar estos desafíos, ya hemos desarrollado y validado una plataforma de microarrays pan-viral llamada Virochip con la capacidad de detectar todos los virus conocidos, así como nuevas variantes sobre la base de la homología de secuencia conservada 1. Utilizando el Virochip, hemos identificado la gama completa de los virus asociados con las infecciones respiratorias, incluyendo los casos de enfermedades inexplicables crítico en los pacientes hospitalizados, con una sensibilidad igual o superior a 5.2 convencionales de ensayos clínicos. El Virochip también se ha utilizado para identificar nuevos virus, incluyendo el coronavirus del SRAS 6,7, un clado rinovirus novela 5, XMRV (un retrovirus relacionados con el cáncer de próstata) 8, bornavirus aviar (la causa de una enfermedad degenerativa en los loros) 9, y una novela Cardiovirus en niños con enfermedades respiratorias y diarreicas 10. La versión actual de la Virochip ha sido portado a una plataforma de microarrays de Agilent y consta de ~ 36.000 sondas derivadas de más de ~ 1.500 virus en el GenBank de diciembre de 2009. Aquí nos demuestran los pasos a seguir en el procesamiento de un ensayo de Virochip de principio a fin (~ 24 horas el tiempo de entrega), incluyendo la extracción de ácidos nucleicos de muestras, amplificación por PCR utilizando cebadores aleatorios, la incorporación de un colorante fluorescente, y la hibridación de microarrays, la exploración y el análisis.

El Virochip es un microarray de pan-viral diseñada para detectar de forma simultánea todos los virus conocidos, así como nuevos virus sobre la base de la homología de secuencia conservada. Aquí se demuestra cómo ejecutar un ensayo de Virochip para analizar las muestras clínicas para determinar la presencia de virus conocidos y desconocidos.

El uso de un ensayo de microarrays Pan-viral (Virochip) a la pantalla de muestras clínicas de los patógenos virales

El diagnóstico de las causas virales de muchas enfermedades infecciosas es difícil debido a la diversidad de secuencias inherente a los virus, así como a la aparición continua...

Este procedimiento utiliza el Viro chip, un ensayo de microarreglo panviral para analizar muestras clínicas en busca de virus conocidos y desconocidos. Primero, se extraen ácidos nucleicos de las muestras clínicas. A continuación, el ARN extraído se transcribe inversamente utilizando cebadores aleatorios.Se realiza la síntesis del ADN de la segunda cadena y la biblioteca de ADN se amplifica mediante PCR aleatoria. Luego, el ADN amplificado se marca con colorantes fluorescentes y se hibrida en un microarreglo de chip viral. El paso final consiste en escanear y analizar el microarreglo.Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran la presencia o ausencia de un virus o de varios virus mediante el análisis del microarreglo de la tarjeta. Se necesitan métodos de detección de amplio espectro, como el microarreglo de tarjeta viral, en microbiología diagnóstica porque los síndromes clínicos comunes, como la neumonía, no son específicos de ningún patógeno individual, y debido a la amenaza constante de nuevos patógenos virales emergentes, tales como el coronavirus del SARS y el virus de la gripe H1N1 novedoso de 2009. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología diagnóstica, como qué porcentaje de infecciones sin diagnóstico en el entorno clínico podrían ser causadas por virus novedosos aún no identificados. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia un mejor diagnóstico de enfermedades clínicas agudas en el hospital, ya que estamos analizando cientos a miles de patógenos potenciales simultáneamente.La idea original de este método surgió en 2002, cuando decidimos aplicar la tecnología recién desarrollada de microarreglos, pionera en el laboratorio del Dr. Joseph DeRisi en la UCSF, a la detección de virus. Nuestro primer caso práctico fue utilizar el chip viral para identificar un nuevo coronavirus responsable del SARS en 2003. A continuación se muestra el procedimiento completo, desde el inicio hasta el final, que será realizado por un técnico de mi laboratorio, quien demostrará el uso del ensayo con el chip viral en una muestra de hisopo nasal de un niño para diagnosticar la causa de su enfermedad respiratoria aguda. Las muestras de hisopado nasofaríngeo se recogen en recipientes estériles que contienen medio líquido de transporte viral y se almacenan congeladas en un congelador a menos 80 grados Celsius.En una cabina de seguridad biológica, deje que el tubo que contiene la muestra se descongele y agite brevemente el hisopo en el medio antes de desechar el hisopo en un recipiente para residuos biopeligrosos. A continuación, alícuota 200 microlitros de la muestra en un tubo de 1,5 mililitros. Pase la muestra a través de un filtro de centrifugación de 0,22 micrones para purificar las partículas virales y recójala en un tubo nuevo de 1,5 mililitros.A continuación, utilice el kit Turbo DNA de Ambien según las instrucciones del fabricante para degradar el ADN genómico del huésped y purificar el ácido nucleico viral encapsulado protegido. A continuación, realice la extracción de ARN utilizando el kit de extracción de ARN viral XMO ZR o el kit de virus de Qiagen ultrasound según las instrucciones del fabricante. Mida la concentración del ARN extraído utilizando un espectrofotómetro de ácidos nucleicos NanoDrop.La concentración de ARN debe ser preferiblemente de al menos 10 nanogramos por microlitro, aunque variará de muestra a muestra utilizando un tubo de pared delgada de 200 microlitros. Añada un microlitro del cebador A a una concentración de 40 picomoles por microlitro a cuatro microlitros de ARN extraído. Incube la muestra a 65 grados Celsius durante cinco minutos en un termociclador y luego deje que el tubo se enfríe a temperatura ambiente durante cinco minutos.A continuación, agregue cinco microlitros de una mezcla maestra que contiene dos microlitros de tampón RT al cinco veces, un microlitro de dNTP 12,5 milimolar, un microlitro de agua, 0,5 microlitros de DTT 0,1 molar y 0,5 microlitros de transcriptasa inversa superscript three, en un termociclador. Incube el tubo a 42 grados Celsius durante 60 minutos. Luego caliente la muestra a 94 grados Celsius durante dos minutos.Para detener la reacción de transcripción inversa, incubar a 10 grados Celsius durante dos minutos y centrifugar brevemente durante cinco segundos. A continuación, añadir cinco microlitros de mezcla de quease compuesta por un microlitro de tampón de quease al cinco veces, 3,8 microlitros de agua y 0,15 microlitros de quease para la síntesis de la segunda cadena. Elevar la temperatura del termociclador de 10 grados Celsius a 37 grados Celsius durante ocho minutos.Mantenga a 37 grados Celsius durante ocho minutos. Luego caliente a 94 grados Celsius durante dos minutos para inactivar la enzima y reduzca a 10 grados Celsius en este punto. Si se desea, almacene la muestra que contiene 15 microlitros de ADNc a menos 20 grados Celsius.Primero, agregue cinco microlitros de la muestra de ADN a 45 microlitros de una mezcla maestra que consiste en cinco microlitros de tampón de PCR 10 veces, un microlitro de dNTP 12,5 milimolar, un microlitro de cebador a 100 pmoles por microlitro, B, un microlitro de Cleantech LA y 37 microlitros de agua. Luego, realice el protocolo de PCR de la siguiente manera: 94 grados Celsius durante dos minutos, seguido de 25 ciclos de 94 grados Celsius durante 30 segundos, 50 grados Celsius durante 45 segundos y 72 grados Celsius durante un minuto.Luego, un paso de elongación a 72 grados Celsius durante cinco minutos, seguido de una incubación a 10 grados Celsius tras la PCR. Verifique el producto de PCR en un gel de electroforesis de AOSE al 1,5%. Debe observarse una mancha difusa de aproximadamente 200 a 1000 pares de bases.Para incorporar AAD DNTP, agregue cinco microlitros de producto de PCR viral a 45 microlitros de una mezcla maestra que consiste en cinco microlitros de tampón de PCR 10 veces, un microlitro de A-A-D-N-T-P 12,5 milimolar, un microlitro de 100 p por microlitro múltiple del cebador B, un microlitro de ClinTech LA y 37 microlitros de agua. Ejecute el protocolo de PCR de la siguiente manera: 94 grados Celsius durante dos minutos, 15 ciclos de 94 grados Celsius durante 30 segundos, 50 grados Celsius durante 45 segundos.72 grados Celsius durante un minuto y un paso de extensión de 72 grados Celsius durante cinco minutos, y mantener a 10 grados Celsius. Luego, purifique el nuevo producto de PCR con el kit DNA Clean and Concentrator-3 según las instrucciones del fabricante y suspenda en 10 microlitros de tampón de elución. Añada un microlitro de bicarbonato de un molar y un microlitro de si tres al 10 microlitros de producto de PCR e incube durante una hora en la oscuridad.A continuación, limpie nuevamente la muestra etiquetada con S utilizando el kit DNA Clean and Concentrator-5 y eluya en 12 microlitros de tampón de elución. Utilice 1,5 microlitros de muestra para verificar la concentración de ADNc y la cantidad de colorante incorporado en un espectrofotómetro NanoDrop, en un tubo tipo tira para PCR, con 1 microlitro de tampón de fragmentación 25 veces, 5 microlitros de tampón de bloqueo 5 veces, 9,5 microlitros o la cantidad necesaria para una concentración final normalizada de 10 picomoles o moles por microlitro de la muestra etiquetada con SI3 y agua hasta un volumen total de 25 microlitros. Luego, agregue 25 microlitros de tampón de hibridación GX 2 veces y centrifugue brevemente para eliminar burbujas.Coloque un nuevo portaobjeto con junta en la cámara de hibridación. Añada 40 microlitros de la muestra sobre el portaobjeto con junta. A continuación, coloque el microarreglo viral impreso por Agilent con el lado marcado Agilent hacia abajo encima del portaobjeto con junta y apriete firmemente el tornillo.Coloque la cámara de hibridación en un horno a 65 grados Celsius e hibride durante la noche utilizando una rotación lenta de 10 rotaciones por minuto para lavar los arreglos. Primero caliente el tampón dos a 37 grados Celsius mientras calienta. Llene un recipiente plástico de 500 mililitros con aproximadamente 250 mililitros del tampón.Uno.Retire el microarreglo de la cámara de hibridación, sumerja el microarreglo y sepárelo de la lámina de junta. Transfiera el microarreglo al recipiente limpio y lávelo en el tampón uno durante un minuto. Luego, utilizando un recipiente plástico separado de 500 mililitros.Lave el microarreglo en el tampón dos precalentado durante un minuto. Después del lavado, retire lentamente el microarreglo del tampón dos, teniendo cuidado de evitar burbujas.Utilice una toalla de papel para eliminar el exceso de humedad, teniendo cuidado de evitar tocar directamente el lado activo del arreglo. Finalmente, coloque el portaobjetos en el portador de diapositivas con el lado Agilent hacia arriba e insértelo en el escáner de arreglos. En este procedimiento, utilizamos un escáner de microarreglos de ADN Agilent de dos micrones.Analice la matriz etiquetada SI tres a cinco micrones o dos micrones según el protocolo estándar de escaneo del instrumento. Analice las micromatrices virales mediante análisis de conglomerados o el programa automatizado de análisis de micromatrices RO e unpredic. Mediante la micromatriz Viro Chipp, el virus de la influenza H uno N uno novel 2009 se detecta fácilmente en la muestra de hisopo nasal obtenida de un niño con una enfermedad similar a la influenza.Además, hemos demostrado que el chip viral es capaz de identificar no solo virus respiratorios, sino también una amplia variedad de virus procedentes de diferentes tejidos y fluidos corporales. Algunos ejemplos de detección de virus en sangre completa y suero utilizando el vichi se muestran aquí. Estas son llamadas ere correspondientes al microrray del chip viro a partir de muestras de sangre, ya sea sangre completa o suero, obtenidas de cuatro pacientes; para cada muestra, se muestran las dos primeras predicciones virales, siendo la primera predicción la que presenta el valor de P más bajo.Por ejemplo, en la muestra resaltada en azul claro, la predicción principal para esa muestra es el virus del dengue tipo uno. Aunque la segunda predicción en orden es el virus del dengue tipo dos, el virus real presente en esa muestra de sangre completa fue confirmado como el virus del dengue tipo uno, en concordancia con los resultados de dict. Otra aplicación del virochip es el descubrimiento de patógenos novedosos.Algunos ejemplos incluyen los descubrimientos del coronavirus SARS X-M-R-V-A, el retrovirus OME relacionado con el cáncer de próstata y el síndrome de fatiga crónica en humanos y el HTCV, un nuevo virus cardíaco humano asociado con infecciones respiratorias y diarreicas en niños. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 12 horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar asegurar la disponibilidad de todo el equipo y los reactivos necesarios siguiendo este protocolo.Otros métodos, como la amplificación específica de virus mediante PCR y la secuenciación profunda, pueden realizarse para confirmar y hacer seguimiento de patrones inusuales de hibridación en el chip viral o de resultados del chip viral que sugieran la presencia de un virus novedoso tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la oncología exploraran la asociación de virus novedosos con el cáncer, en los campos de la biodefensa y la microbiología clínica para desarrollar ensayos microscópicos condensados destinados al diagnóstico rápido de patógenos, y en el campo de la virología para la caracterización de virus novedosos y su asociación con enfermedades. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo realizar todos los pasos del ensayo de micromatriz viral, una prueba de vigilancia de amplio espectro para detectar patógenos virales en muestras clínicas, desde la extracción de ácidos nucleicos a partir de muestras clínicas hasta la hibridación y análisis en micromatriz.No olvide que trabajar con muestras clínicas se considera un riesgo biológico y que la extracción de ácidos nucleicos debe realizarse en laboratorios clasificados al nivel de bioseguridad dos o superior.

using-pan-viral-microarray-assay-virochip-to-screen-clinical-samples

Research

Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

A continuación se describe un reverso transcriptasa optimizado multiplex PCR cuantitativa (QRT-PCR) en combinación con el protocolo de una plataforma de microfluidos como un costo y el tiempo efectivo instrumento de cribado de alto rendimiento para los microRNA (miRNA) los niveles de expresión, especialmente cuando se trabaja con cantidades limitadas de muestras.

Perfiles de microARN de alto rendimiento: Multiplex Optimizado QRT-PCR en la escala de nanolitros de la IFC Fluidigm dinámica ArrayTM

ampliPHOX tecnología de detección colorimétrica se presenta como una alternativa económica a la detección por fluorescencia de microarrays. Sobre la base de fotopolimerización, ampliPHOX produce manchas de polímero sólido visible a simple vista en tan sólo unos minutos. Resultados son imágenes e interpretado de forma automática con un paquete de software simple pero poderosa.

ampliPHOX colorimétrico de detección de un microarray de ADN para la influenza

En este video, demostramos el proceso para detectar isotipos de anticuerpos en múltiples muestras de suero humano utilizando un portaobjetos de microarray impreso con subtipos antigénicos de cepas del virus de la influenza.

Ensayo de microarrays de antígenos virales para detectar isotipos de anticuerpos en suero contra antígenos virales

Este video muestra un ensayo de fijación viral para la detección de compuestos antivirales. Utilizando el virus de la hepatitis C modificado genéticamente y la luciferasa, evalúa los efectos inhibitorios sobre la adhesión viral, como lo indica la menor intensidad de luz en los pocillos tratados conjuntamente en comparación con los pocillos tratados con el virus solo.

Un ensayo de unión viral para la detección de compuestos antivirales

Un sistema integrado de chip microfluídico termoplástico ha sido desarrollado para su uso como un diagnóstico molecular. El chip realiza la extracción de ácido nucleico, la transcriptasa inversa y la PCR. Los métodos para fabricar y ejecutar el chip se describen.

Fabricación de chips de microfluidos y método para detectar la influenza

Retrovirus endógenos humanos (HERV), que ocupan 8% del genoma humano, conservan la capacidad de codificación de los escasos pero cien mil repeticiones terminales largas (LTRs). A Affymetrix microarray costumbre fue diseñado para identificar la expresión locus HERV individual y se utilizó en los tejidos de cáncer de próstata como una prueba de concepto para futuros estudios clínicos.

La identificación basada en microarrays de expresión individual HERV Loci: Aplicación al descubrimiento de biomarcadores en el cáncer de próstata

Tres ensayos, incluyendo el efecto citopático (CPE) a base de ensayo, ensayo de dosis-respuesta y (TOA) ensayo de tiempo-de-Adición se han desarrollado, optimizado, validado y utilizado para identificar nuevos antivirales contra el virus de la lengua azul (BTV), así como para determinar el posible mecanismo de acción-de-(Ministerio de Agricultura) de antivirales recientemente identificados.

Los ensayos para la identificación de nuevos antivirales contra la fiebre catarral ovina Virus

En ensayos in vitro para medir la replicación del virus se han mejorado en gran medida por el desarrollo de virus de ARN recombinantes que expresan luciferasa u otras enzimas capaces de bioluminiscencia. A continuación te detallamos una tubería de cribado de alto rendimiento que combina dichas cepas recombinantes de virus del sarampión y chikungunya para aislar a los antivirales de amplio espectro de bibliotecas químicas.

Screening de alto rendimiento para los de amplio espectro químico Inhibidores de Virus ARN

pruebas de alto rendimiento de ADN y ARN patógenos basados ​​por nanoescala PCR se describe el uso de un canino sindrómica y el panel de PCR respiratoria equina.

La detección de alto rendimiento de los patógenos respiratorios de especímenes animales por PCR nanoescala

Aquí se describe un protocolo para el empleo de proyección de ARNi de alto rendimiento para descubrir destinos host que se pueden manipular para mejorar la terapia de virus oncolíticos, específicamente rhabodvirus y vaccinia virus terapia, pero puede adaptarse fácilmente a otros oncolíticos plataformas de virus o para descubrir genes de host que modulan generalmente replicación del virus.

Detección del genoma-ancha de RNAi para identificar los Host factores que modulan la terapia de Virus oncolíticos

Aprende el ensayo Virochip para detectar virus conocidos y novedosos en muestras clínicas mediante microarrays pan-virales. Este método mejora el diagnóstico microbiológico en entornos hospitalarios.

El uso de un ensayo de microarrays Pan-viral (Virochip) a la pantalla de muestras clínicas de los patógenos virales

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