Name: El estudio de la integración de los adultos nacidos en las neuronas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprenda a estudiar la integración funcional de neuronas nacidas en adultos en el hipocampo de ratones mediante inyección estereotáxica de retrovirus y técnicas de electrofisiología de patch-clamp. Este método permite analizar la maduración sináptica.

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Este trabajo fue financiado por el NINDS y la Asociación Americana del Corazón para S.Ge. Este enfoque fue creado y desarrollado originalmente por el autor en el laboratorio del Dr. Hongjun canción en la Universidad Johns Hopkins. Nos gustaría dar las gracias al Dr. Song Hongjun por su orientación y apoyo.

1. Virus de la inyección Alto título de retrovirus modificados (1 x 10 9 unidades / ml) es producida por la co-transfección de vectores retrovirales y VSVG en las células HEK293T, seguido por ultracentrifugación de sobrenadante viral. Para las fuentes y los métodos de producción, de ver la demostración JoVe excelente (3). Nota: adultos jóvenes (4-6 semanas de edad) mujeres ratones C57BL / 6 (Charles River) se encuentran en condiciones normales. Todos los procedimientos siguen la guía del Consejo Nacional de Investigación para el cuidado y uso de animales de laboratorio bajo un protocolo aprobado por la Universidad de Stony Brook IACUC. <ol><li> 2UL deshielo de los retrovirus por animal congelado en el hielo. </li><li> Anestesiar (100 mg de ketamina + 10 xilazina microgramos por gramo de peso corporal) y montar el animal en un marco estereotáxico (Steolting). Quitar el pelo en la cabeza y limpiar la piel con etanol al 70%. </li><li> Exponer el cráneo y perforar cuatro pozos someros con un taladro dental (broca de 0,6 mm) en las siguientes coordenadas: <ul><li> anterioposterior = -2 mm de bregma, lateral = ± 1,6 mm; ventral = 2,5 mm; anterioposterior = 3 mm de bregma, lateral = ± 2,6 mm; ventral = 3,2 mm. </li><li> anterioposterior = -2 mm de bregma, lateral = ± 1,6 mm; ventral = 2,5 mm; anterioposterior = 3 mm de bregma, lateral = ± 2,6 mm; ventral = 3,2 mm. </li></ul></li><li> Montar un Hamilton 1μl, plana punta de la jeringa e inyectar 0,5 l por retrovirus lugar a una tasa de 0,25 l / min en el giro dentado. (Ver las coordenadas por encima de la profundidad ventral.) Pausa 2 minutos después de cada inyección antes de retirar la jeringa lentamente para evitar el reflujo de líquido. Entre las inyecciones, una breve aclaración de la superficie externa de la punta de la jeringa con PBS estéril y un aplicador para eliminar los rastros de sangre. </li><li> Cerrar la herida con material estéril sutura quirúrgica (tipo P-1; Tamaño 6-0) y devolver el animal a las condiciones de vivienda estándar hasta las etapas de tiempo deseado después de la inyección. </li></ol> 2. Preparación Cortar Para obtener cortes de alta calidad aguda de ratones adultos, se utiliza una solución de corte modificado para la preparación de corte (ver más abajo). <ol><li> Pre-corte chill solución a 0-4 º C en el hielo y la burbuja con un 95% de O 2 -5% de CO 2 por lo menos durante 30 minutos. </li><li> Anestesiar y transcardially perfundir un animal con helado de oxígeno de una solución saturada de corte. </li><li> Quite rápidamente el cerebro en un petri plato con papel de filtro pre-humedecido con una solución fría, oxigenada de corte. Cortar el cerebelo y la porción de una superficie de montaje de al menos 1 mm anterior a las coordenadas de la inyección (visible). Pegue el cerebro en una etapa vibrotome y montarlo en la cámara de corte llena con una solución de corte en frío y oxigenado. </li><li> Prepare cortes coronales u horizontal (300-350μm) y la transferencia con una pipeta de mayor diámetro para una cámara de incubación a temperatura ambiente que contiene ACSF burbujas con un 95% O 2 / 5% CO 2. </li><li> Incubar los cortes, burbujas de forma continua, a 32 ° C durante 30-60 minutos. Devolver la cámara a temperatura ambiente durante la duración de la grabación. </li></ol> 3. Los experimentos electrofisiológicos <ol><li> Los sectores se transfieren a la cámara de grabación que está continuamente perfundidos con ACSF saturada de oxígeno a 32 ° C - 34 ° C. </li><li> Un electrodo de estimulación bipolar de tungsteno se coloca en la capa molecular del giro dentado con un objetivo de microscopio óptico bajo (10 veces). </li><li> PED recién nacido en la zona sub-granular / capa de células granulares se identifican por la expresión de GFP o dTomato. De células enteras de grabación patchclamp se realiza en las neuronas recién nacidas bajo aumento (40X). </li><li> Propiedades de disparo de las células registradas se obtienen mediante la inyección de una serie de corrientes en el modo actual-clamp. </li><li> Estímulos eléctricos son entregados por el electrodo de estimulación a través de un aislador de la estimulación controlada por el software de grabación, y evocó las corrientes postsinápticas en el PED recién nacidos se registran. </li></ol> 4. Análisis de Datos Amplitudes de las respuestas evocadas postsináptica se analizan en las distintas fases de los adultos nacidos en las neuronas. 5. Resultados representante Utilizando el protocolo anterior, la expresión de GFP en el recién nacido neuronas giro dentado similar a la Figura 1 es común. Tenga en cuenta que las neuronas recién nacidas que es fácil ver y tanto dendritas y los axones están marcados con firmeza. Expresión en los axones delgados DGC y pequeñas espinas depende de la calidad y el título del virus, el promotor utilizado y la longitud de la expresión in vivo. En nuestras manos, las células del recién nacido y orgánulos subcelulares son generalmente visibles a los pocos días después de la inyección, y la expresión de la columna vertebral puede ser rastreado desde las primeras etapas de desarrollo. Wcélula-agujero grabaciones de las neuronas recién nacidas en las etapas de tiempo diferentes permitir el estudio de propiedades únicas células del recién nacido, por ejemplo, los potenciales de acción (figura 2a), así como el proceso de integración sináptica en los actuales circuitos neuronales durante la maduración (Figura 2b). <img src="/files/ftp_upload/2548/2548fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 de 2 fotones imagen confocal de neuronas recién nacidas en una sección horizontal de giro dentado de un ratón adulto. Las células verdes son 21dpi (días después de la inyección) que expresan GFP PED recién etiquetados con PUX-GFP retrovirus. <img src="/files/ftp_upload/2548/2548fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 a, b) Potencial de acción disparando propiedades de un recién nacido DGC a los 21 dpi.) Representante evocó excitatorios postsinápticos corrientes (EPSCs) grabado en un recién nacido DGC a los 21 dpi.

<ol><li>Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functional+implications+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis.</a> Cell. 132, 645-660 (2008).</li>
<li>Ge, S., Goh, E. L., Sailor, K. A., Kitabatake, Y., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+regulates+synaptic+integration+of+newly+generated+neurons+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">GABA regulates synaptic integration of newly generated neurons in the adult brain.</a> Nature. 439, 589-593 (2006).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
</ol>

Neurogénesis continua en el hipocampo de cerebros de los mamíferos adultos proporciona un sistema único modelo experimental para estudiar el desarrollo y la integración neuronal en el cerebro maduro. El protocolo se presenta aquí combina etiquetado retrovirales y métodos electrofisiológicos para estudiar la integración de los recién nacidos las neuronas granulares dentadas en los cerebros de ratones adultos. Para asegurarse de que sus experimentos tienen éxito, se recomienda lo siguiente durante las etapas críticas del procedimiento: Para evitar la infección y la inflamación no deseados, todos los instrumentos deben ser esterilizados (por autoclave, cualquier tipo de esterilización, o el 70% de etanol) antes de la cirugía. Use PBS estéril para lavar la punta de la aguja de la jeringa antes de la inyección. Para la inyección de virus, los animales deben estar bien montado en el dispositivo estereotáxico y fuentes de los movimientos innecesarios deben ser minimizadas durante la inyección. Asegúrese de que la cabeza está bien fijo y firme, y ajustar la posición de la nariz del ratón a nivel de bregma y lambda antes de la inyección de cálculo de coordenadas. Extracto de virus en la jeringa rápidamente para minimizar la exposición a temperatura ambiente - Los retrovirus son particularmente sensibles a la temperatura. Inyectar lentamente virus en la dosis recomendada para minimizar el daño de presión. Uso de la recomendada de punta plana jeringa (vs. punta biselada común) se asegurará una distribuida uniformemente zona dentada infección giro. Antes de preparar las rebanadas, corte de la solución y la incubación de ACSF se burbujea con un 95% de CO 2 O 2 al 5% por lo menos 30 minutos para permitir que el oxígeno para saturar las soluciones. Los animales deben ser perfundidos con rapidez y mantener el tejido en frío, saturada de oxígeno solución para la mejor calidad de corte. Para la grabación, aumento de la intensidad del estímulo gradualmente hasta que haya una respuesta postsináptica. Cambiar la ubicación de los electrodos de estimulación en la capa molecular del giro dentado según sea necesario. En resumen, el enfoque recomendado ofrece una manera de explorar distintas propiedades y posible papel funcional de los adultos nacidos en las neuronas durante las primeras etapas de integración en los circuitos activos, maduros.

<ul><li> Solución de corte (en mm): 110 cloruro de colina, 2,5 KCl, 1,3 KH 2 PO 4, 25,0 NaHCO3, 0,5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 10 de dextrosa, 1.3 ascorbato de sodio, 0,6 piruvato de sodio, ácido 5,0 quinurénico. </li><li> Artificial líquido cefalorraquídeo (ACSF, en mM): NaCl 125,0, 25,0 NaHCO3, 2,5 KCl, 2 CaCl 2, 1,3 KH 2 PO 4, 1,3 MgCl 2, 1,3 ascorbato de sodio, 0,6 piruvato de sodio, 10 de dextrosa. </li><li> Solución interna de células enteras patchclamp (en mM): 120 gluconato de potasio, KCl 15, 4 MgCl 2, 0,1 EGTA, HEPES 10,0, 4 MgATP, 0,3 Na 3 GTP, 7 fosfocreatina (pH 7,4, 300 mOsm). </li></ul>

el estudio de la integración de los adultos nacidos en las neuronas

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogénesis ocurre en adultos cerebro de los mamíferos en la zona sub-ventricular (SVZ) del ventrículo lateral y en la zona sub-granular (SGZ) de la circunvolución dentada del hipocampo durante toda la vida. Estudios previos han mostrado que la neurogénesis del hipocampo adulto se asocia con trastornos cerebrales diversos, como la epilepsia, la esquizofrenia, la depresión y la ansiedad (1). Descifrar el proceso de integración de las neuronas normales y aberrantes de adultos nacidos pueden arrojar luz sobre la etiología de estas enfermedades e informar el desarrollo de nuevas terapias. Neurogénesis adulta SGZ espejos desarrollo neuronal embrionario y postnatal, incluyendo las etapas de especificación de destino, la migración, la integración sináptica, y la maduración. Sin embargo, la plena integración se produce durante un prolongado período de 6 semanas. Entrada inicial sináptica de adultos nacidos en las células granulares SGZ dentado (PED) es GABAérgicas, seguido por la entrada glutamatérgica a los 14 días (2). Los factores específicos que regulan la formación de circuitos de adultos nacidos en las neuronas del giro dentado se desconoce en la actualidad. Nuestro laboratorio utiliza una replicación deficiente vector retroviral basado en el virus de la leucemia murina Moloney para entregar las proteínas fluorescentes y la hipótesis de los genes reguladores de estas células en proliferación. Esta técnica ofrece una alta especificidad viral y la resolución para el análisis de la fecha de nacimiento de células, el linaje, la morfología y sinaptogénesis. Un experimento típico emplea a menudo dos o tres tipos de virus que contiene la etiqueta única, los transgenes, y los elementos promotores de una sola célula de análisis de un proceso de desarrollo deseado en vivo. El siguiente protocolo describe un método para el análisis de la integración funcional de las neuronas recién nacido con un único color verde (GFP) o rojo (dTomato) retrovirus proteína fluorescente y patch clamp-electrofisiología.

Una manera de estudiar la integración de los recién nacidos las células granulares dentadas en los animales adultos se describe. Esta técnica utiliza un retrovirus modificados para etiquetar las neuronas recién nacidas, seguido por los registros electrofisiológicos para determinar la integración funcional en vivo.

El estudio de la integración de los adultos nacidos en las neuronas

La neurogénesis ocurre en los cerebros de mamíferos adultos en la zona subventricular (ZSV) del ventrículo lateral y en la zona subgranular (ZSG) de la ...

El objetivo general de este procedimiento es presentar un método para estudiar la integración funcional de las células granulares del giro dentado generadas en la edad adulta. Esto se logra primero mediante la inyección estereotáxica de un retrovirus en el giro dentado de ratones adultos para marcar las células granulares del giro dentado recién nacidas. El segundo paso del procedimiento consiste en perfundir los ratones en determinadas etapas temporales con una solución fría de corte y extraer el cerebro.El tercer paso del procedimiento consiste en preparar cortes cerebrales agudos con un vibrátomo. El cuarto paso del procedimiento consiste en realizar grabaciones de parche en configuración de célula entera en células granulares dentadas recién nacidas y estimular la capa molecular de cortes cerebrales agudos. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran la integración sináptica funcional de neuronas recién nacidas mediante el registro y análisis de corrientes postsinápticas evocadas en neuronas granulares dentadas recién nacidas.Las principales ventajas de esta técnica son la transducción retroviral de neuronas recién formadas en el cerebro adulto y la preparación aguda de cortes cerebrales a partir de animales adultos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurogénesis adulta, como la pérdida funcional de las neuronas recién formadas en el cerebro adulto. Prepárese para la inyección del virus retirando el retrovirus que expresa la proteína verde fluorescente GFP o la proteína roja fluorescente D tomate del congelador y descongelándolo sobre hielo. Descongele.Dos microlitros de retrovirus por animal anestesian un ratón hembra de cuatro a seis semanas de edad. Compruebe la anestesia pellizcando la pata, coloque el ratón en un estereotáxico, afeite el pelo de la cabeza y limpie la piel con etanol al 70 %. Utilice un bisturí para cortar la piel y exponer el cráneo.Ajuste la posición del hocico del ratón para que bgma y lambda queden en el mismo plano horizontal utilizando una fresa dental con una broca de 0,6 milímetros. Taladre cuatro orificios a través del cráneo en las coordenadas mostradas aquí. Llene rápidamente una jeringa Hamilton de punta plana de un microlitro con el retrovirus descongelado.Colóquelo por encima de uno de los orificios creados a menos dos milímetros bgma para inyectar el retrovirus en el giro dentado. Baje la jeringa hasta una profundidad vertical de 2,5 milímetros. Inyecte 0,5 microlitros de retrovirus a una velocidad de 0,25 microlitros por minuto para evitar el reflujo de líquido.Espere dos minutos después de cada inyección antes de retirar lentamente la jeringa. Enjuague brevemente la superficie externa de la punta de la jeringa con PBS estéril y un aplicador para eliminar rastros de sangre. Utilice el mismo procedimiento para inyectar 0,5 microlitros de retrovirus en los otros tres sitios a profundidades ventrales de 2,5 o 3,2 milímetros.Cierre la herida con material de sutura quirúrgica estéril y devuelva el animal a su alojamiento hasta que las neuronas recién formadas hayan alcanzado la fecha deseada de madurez. Después de transcurridos 21 días, prepárese para seccionar el cerebro del ratón preparando las soluciones necesarias. Enfríe la solución de corte en hielo a entre cero y cuatro grados Celsius y burbujee con 95%oxígeno, 5%dióxido de carbono durante al menos 30 minutos.Coloque el líquido cefalorraquídeo artificial o LCR a temperatura ambiente y burbujee con 95%oxígeno, 5%dióxido de carbono durante al menos 30 minutos. Después de 30 minutos sobre hielo, prepare la solución de corte saturada con oxígeno llamada hielo para perfusión cardíaca. Después de anestesiar al ratón, realice la perfusión cardíaca.Luego, retire rápidamente el cerebro y colóquelo en una placa de Petri que contenga solución de corte y un trozo de papel de filtro dentro de la placa. Corte el cerebelo y luego realice un corte coronal de uno a dos milímetros anterior a los sitios de inyección para obtener una superficie plana. Para montar superior.Coloque el cerebro sobre una plataforma de vibram. Monte la plataforma en la cámara de corte del vibram, que debe estar llena con solución de corte oxigenada. Baje la cuchilla y ajuste la ventana de corte en el Vibram.Comience a cortar el tejido. Corte cada sección en dos mitades a lo largo de la línea media. Utilice una pipeta de gran orificio para transferir estas secciones a una cámara de incubación que contenga aire ambiente.Temperatura A LCR burbujeado con 95% oxígeno y 5% dióxido de carbono. Continúe cortando hasta que sea visible el extremo anterior del hipocampo. Incube los cortes burbujeando continuamente en el baño de agua a 32 grados Celsius durante 30 a 60 minutos.Devuelva la cámara de incubación a la temperatura del borde durante toda la duración de la grabación. Los cortes ya están listos para la grabación. Comience perfundiendo la cámara de registro con A CSF saturado de oxígeno a 32-34 grados Celsius a aproximadamente dos mililitros por minuto.Utilice un perpet de gran tamaño para transferir una sección a la cámara de registro. Coloque un alambre de platino en forma de U con hilos de nailon encima de la sección para mantenerla fija bajo baja magnificación. Identifique la capa molecular del giro dentado.Luego, baje el electrodo de estimulación hasta la capa molecular del giro dentado. En condiciones de alta. Identifique las células granulares dentadas recién formadas en la zona subgranular o en la capa granular mediante la expresión de la proteína fluorescente verde o roja marcadora.Localice neuronas recién formadas que expresan GFP o D tomato cambiando entre filtros DIC y de fluorescencia. Seleccione una célula con fluorescencia relativamente intensa y un cuerpo celular saludable para el registro mediante parche en modo célula íntegra. Introduzca una micropipeta de vidrio con una resistencia de punta de tres a seis megaohmios, rellena con la solución interna adecuada, en un porta-micropipetas situado en la etapa del amplificador, bajo el objetivo de alta magnificación del microscopio.Baje la micropipeta mediante un micromanipulador hasta la célula granular dentada seleccionada y forme un parche de célula íntegra. Inyecte una serie de corrientes en modo de fijación de corriente y registre las propiedades de disparo del nuevo neurona. Aplique un pulso único o pulsos dobles eléctricos tii mediante el electrodo de estimulación y registre las corrientes postsinápticas evocadas.Si no hay respuesta post-sináptica, mueva el electrodo de estimulación a otra posición en la capa molecular e intente registrar las corrientes post-sinápticas evocadas desde la nueva ubicación del estímulo. Tras finalizar el experimento, utilice ajuste de bloqueo para medir la amplitud de las respuestas post-sinápticas evocadas en las neuronas recién formadas. Esta figura muestra la expresión de GFP en neuronas recién formadas en el giro dentado de un ratón adulto 21 días después de la inyección del retrovirus GFP.Téngase en cuenta que las neuronas recién formadas son fácilmente visualizables y que tanto las dendritas como los axones están rotulados de manera robusta. Las dendritas son los procesos que se extienden desde el soma hacia la capa molecular del giro dentado, y los axones también son visibles en los hilos y en el área CA3. Esta figura muestra grabaciones de clamping de corriente en toda la célula de una célula granular dentada recién formada a los 21 días después de la inyección del retrovirus P-U-X-G-F-P en un ratón adulto.El trazo superior muestra potenciales de acción provocados por la inyección de corriente. Esta figura muestra corrientes postsinápticas provocadas en una célula granular del giro dentado recién nacida 21 días después de la inyección del virus. Al estimular en la capa molecular.La existencia de la respuesta posisináptica muestra que la neurona recién formada ya se ha integrado en los circuitos neuronales existentes y está recibiendo entradas sinápticas del ENT de diversos orígenes tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurogénesis adulta exploraran la integración funcional de las neuronas recién formadas en el cerebro adulto.

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