Name: El uso de un sistema de suspensión de peso para la oclusión de la arteria renal aislada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Aprende a inducir isquemia renal en ratones mediante un sistema de peso suspendido para estudiar lesión renal aguda. Este método permite medir la tasa de filtración glomerular mediante inulina marcada con FITC.

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El presente estudio fueron apoyadas por los Estados Unidos Institutos Nacionales de Salud de subvención R01-HL092188, R01-DK083385 y R01HL098294, y la Fundación para la Educación e Investigación de la anestesia (FAER) Subvenciones a HKE, una subvención a la FAER JYD y una investigación de la DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) Fellowship (GR2121/1-1) a AG.

Observaciones generales. Todas las operaciones deberán realizarse bajo un microscopio vertical de disección (Leica) y utilizando un coagulador quirúrgico. Los ratones en los grupos experimentales deben coincidir en edad y peso para asegurar la comparabilidad de los resultados. Administración de la temperatura, la presión arterial, la anestesia y el líquido debe ser estable y controlado durante el experimento. 1. Anestesia y la cirugía <ol><li> Experimentos de isquemia renal puede realizarse de manera simultánea la aplicación de la isquemia y reperfusión en ambos riñones, o después de la nefrectomía simple en combinación con el tratamiento de la isquemia del riñón restante. Como tratamiento de la isquemia bilateral de ambos riñones se asocia con un aumento de las dificultades técnicas, un entorno más complejo y experimental ya la cirugía, vamos a realizar una nefrectomía derecha seguido de un tratamiento de isquemia del riñón izquierdo restante mediante la utilización de un sistema de peso que cuelga. Hemos utilizado este sistema de peso que cuelga también a la oclusión de las arterias coronarias en el corazón. Sin embargo, el procedimiento es diferente, ya que la arteria renal puede ser aislado de los tejidos circundantes, mientras que la arteria coronaria se encuentra en el músculo del corazón. </li><li> Ratones (8-14 semanas de edad, ambos sexos) se anestesiaron con pentobarbital a una dosis de 70mg/kg. Vamos a mantener la anestesia con aprox. 10 mg / kg / h de sodio pentobarbital. La sobredosis puede reducir significativamente la presión arterial y por lo tanto puede alterar los resultados. En nuestros estudios iniciales que también se utiliza la ketamina y xilazina. Sin embargo, estos compuestos induce una bradicardia fuertes (150 / min). Junto a la bradicardia observada también hay evidencia de que ambos compuestos están involucrados en los mecanismos de protección en condiciones de isquemia. Los anestésicos volátiles no puede ser utilizado debido a su capacidad para inducir también la protección renal y presión arterial baja. Por lo tanto, nuestra elección final de la anestesia fue pentobarbital. Además, la ketamina y xilazina se excreta principalmente por vía renal. Nefrectomía y la isquemia puede prolongar la anestesia ketamina. </li><li> Una vez que el dolor reflejos están ausentes (probado por apretar los dedos del pie con pinzas) los ratones se colocan sobre una mesa de calentamiento con control de temperatura (RT, Effenberg, Munich, Alemania, para mantener la temperatura corporal de 37,0 ° C) en posición de decúbito lateral izquierdo. </li><li> Coloque las extremidades inferiores y superiores a la mesa con cinta. </li><li> Para los que no la supervivencia de las cirugías, como se muestra en el vídeo de demostración, cubra el área de la incisión con aceite mineral para evitar la inhalación de pelo del ratón mediante la reducción de la piel y evitar así el riesgo de alergias del pelo del ratón. En el caso de los experimentos de supervivencia de técnicas adecuadas de asepsia incluyendo recorte del vello, la desinfección de la piel con los yodóforos (Betadine, por ejemplo), el manejo de los instrumentos esterilizados en autoclave y el uso de máscaras una guantes estériles para el cirujano se requieren. El aceite mineral no se utiliza en las cirugías de la supervivencia. Para las cirugías de supervivencia estéril de NaCl se utiliza </li><li> Incisión en el flanco derecho se llevará a cabo con una tijera y un electrodo de coagulación (Erbe, ICC50, Alemania) para prevenir el sangrado de los músculos y vasos de la piel. En contraste con el acceso a los riñones a través de laparotomía media, esta técnica no requiere el acceso a la cavidad peritoneal. </li><li> El pedículo renal, incluyendo la arteria renal y vena renal se ligan con sutura 4 / 0 de seda y el riñón derecho se pueden cortar con una tijera, sin interferir con los vasos suprarrenales. </li><li> La herida quirúrgica se cierra con sutura continua (dos puntos) de la pared muscular y la piel con una sutura de 4 / 0. </li><li> Los animales se colocan en una posición de decúbito lateral derecho y una incisión en el flanco izquierdo se realizará. </li><li> El riñón izquierdo se retira cuidadosamente de los tejidos conectivos, evitando la glándula suprarrenal y los vasos. </li><li> A continuación, el riñón se activa con su lado ventral hacia abajo en una taza de lucita. La copa de lucita debe ser esterilizado para las cirugías de supervivencia. El polo del riñón es cuidadosamente introduce dentro del vaso de lucita sosteniendo el tejido circundante con una pinza. A partir de entonces el polo es cuidadosamente introduce dentro del vaso lucite con una pinza. El riñón se mantendrá húmedo y cálido, con un hisopo húmedo empapado con agua a 37,0 ° C. </li><li> Tras la exposición del riñón izquierdo y la colocación en una taza de lucita el titular del riñón es restringido vientre para tener la tensión en los vasos renales. Una restricción suficiente es importante para una exitosa colocación de la sutura en la arteria renal. Posteriormente, el titular de los riñones es fija y la arteria renal se puede identificar fácilmente ya que se ejecuta en la parte superior de la vena renal. </li><li> La arteria renal se diseca los tejidos adyacentes, cerca de su despegue de la aorta abdominal con unas pinzas finas. La arteria se diseca la vena subyacente con una pinza curva en la parte superior. </li><li> Una sutura 8 / 0 de seda (Ethicon, Norderstedt, Alemania) se coloca debajo de la arteria renal mediante el uso deuna pinza como guía principal. Esta técnica permite la interrupción de sólo el flujo de sangre arterial al riñón sin compresión de la vena renal, en comparación con el cierre del pedículo renal. </li><li> La sutura se coloca sobre un palo pequeño (puede ser un pin de seguridad, elaborado) y un peso de aprox. 1 g se adjunta a cada extremo (tubo eppendorf). El peso se puede adaptar al tamaño del riñón mediante la suscripción o la adición de agua en los tubos eppendorf. Sin embargo, la arteria debe ser un poco tirado hacia arriba, de modo que no hay sangre corriendo a través de la arteria, pero sin estirar importante en la arteria. Estrés tramo importante de la arteria puede causar daño de la pared vascular con engrosamiento de la pared arterial y reduce la reperfusión. </li><li> Mientras que los pesos no son compatibles, la arteria renal es inmediatamente obstruida. Por el contrario, cuando los pesos son compatibles, el flujo sanguíneo se restaura inmediatamente a los órganos. La oclusión exitosa se confirma mediante un cambio de color de rojo a blanco. </li><li> Diferentes tiempos de isquemia se pueden realizar como es requerido por el experimento. A la reperfusión completa se llevará a cabo en función de la duración del tiempo de isquemia. Los tiempos de isquemia de 45 minutos permite recuperar la lesión renal. En nuestra configuración experimental se utilizaron 20 a 30 minutos de isquemia debido a una lesión renal medio que nos permite ver la mejora, así como la afectación de los riñones en función de la cepa de ratón y el tratamiento. </li><li> Después de la reperfusión completa del riñón puede ser sustituido de la Copa de lucita. Por lo tanto, el titular de riñón no es fija y la tensión en el riñón se libera. El polo craneal se quita suavemente fuera de la taza con una pinza suave y el polo caudal sigue inmediatamente. </li><li> La fijación (cintas) del ratón puede ser puesto en libertad y el ratón se puede colocar en posición supina, por ejemplo, para FITC-inulina autorización etiquetados. </li><li> En los subgrupos de los experimentos, la presión arterial y el ritmo cardíaco puede ser grabado a lo largo de la intervención quirúrgica. Mediciones de presión arterial son obtenidos de forma continua a través de un catéter en la arteria carótida. En resumen, la arteria carótida se expone a través de una disección roma de los músculos paratraqueales. Después de la exposición y evitar más cuidado de trauma de los tejidos (especialmente del nervio vago), se inserta un catéter en el vaso con dos puntos de sutura y una pequeña abrazadera. La presión arterial se mide con un elemento Statham (WK 280, WKK, Kaltbrunn, Suiza). </li><li> Por FITC aclaramiento de inulina de un catéter tiene que ser colocado en la vena yugular izquierda para perfusión de cloruro de sodio y la inulina marcada con FITC. Además, un catéter en la vejiga tiene que ser insertado para la recolección de orina de una manera dependiente del tiempo, como se explica en detalle a continuación. </li></ol> 2. Medición de la lesión renal <ol><li> En general: Los parámetros de resultados se recomienda lo siguiente para determinar el daño del riñón después de la isquemia renal: Realizar marcado con FITC aclaramiento de inulina para evaluar la tasa de filtración glomerular (TFG). Como alternativa determinar el aclaramiento de creatinina y la creatinina sérica a través de la investigación jaula metabólica 24 horas después de la lesión renal. Realizar renal tinción H &amp; E y la mieloperoxidasa (MPO) de ELISA para determinar el daño renal y la inflamación 24 horas después de la isquemia renal. </li><li> Investigaciones metabólicas jaula: <ol><li> Después de una isquemia del riñón izquierdo se convirtió de nuevo en la posición retroperitoneal y la herida se cierra como se describió anteriormente. </li><li> Al final de la cirugía de los ratones recibir 0,3 ml de solución salina normal IP y recuperar durante 2 horas bajo una lámpara de calentamiento. </li><li> A partir de entonces los ratones se colocan en jaulas metabólicas (Tecniplast Deutschland, Hohenpeissenberg, Alemania) para la determinación de los parámetros funcionales renales de 2 tiempos de 24 horas. </li><li> La toma de agua de cada ratón tiene que ser determinada por el peso del envase vacío y lleno de agua antes de su entrega al ratón y más de 24 horas más tarde por el peso del frasco lleno de nuevo. El peso del ratón ha de determinarse también. </li><li> Después de 24 horas aproximadamente 75μl de sangre se toman del plexo venoso detrás del ojo a través de un tubo capilar bajo anestesia isoflorane corto. </li><li> La función renal se determina mediante la medición de la creatinina en orina y plasma 24 horas después de la isquemia renal mediante un método colorimtric disponibles en el mercado de acuerdo con el fabricante `s del protocolo (LT-SYS, Trabajo + Technik, Berlín, Alemania). Las concentraciones plasmáticas y la orina de Na +, K + se determinan con un fotómetro de emisión de llama (ELEX 6361, Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania). Excreción renal y valores hemodinámicos se calculan utilizando fórmulas estándar 15-17. </li></ol></li><li> La depuración de inulina: FITC-inulina experimentos autorización se llevará a cabo tras la isquemia renal. <ol><li> La vena yugular izquierda se canula para continua infusion. Después de la disección de la vena del tejido adyacente con una tijera de preparación (Dumont, WPI) colocar dos puntos de sutura (4 / 0) alrededor de la vena. Coloque una pinza en la vena antes de la sutura proximale para detener el flujo de sangre. A partir de entonces cerrar el nudo distal y colocar un peso en uno de los extremos distales de sutura a la tensión la tensión en la vena. Esto es muy importante para obtener el catéter en la vena. Use un micro-tijeras para cortar una pequeña abertura en la vena. Mantener la apertura con una pinza fina (Dumont, IPM) y colocar el catéter en la vena. Para avanzar el catéter Remueva la pinza. Asegúrese de que no hay tensión en la sonda de modo que se puede colocar hacia abajo sin que lo sostiene. A partir de entonces cerca de la segunda sutura proximal sobre la vena y el catéter. </li><li> Se coloca un catéter en la vejiga urinaria para la recogida programada de orina. Por lo tanto, se corta una pequeña incisión en la piel sobre la vejiga. Retire con cuidado la vejiga a través del agujero de la piel. Fijar la vejiga con un pañuelo húmedo. Colocar una sutura preparado a lo largo de la vejiga (4 / 0). </li><li> Corte un pedazo pequeño de un catéter (1,5 cm) y el calor en el extremo de conseguir un anillo alrededor del catéter que hace más fácil para arreglarlo en la vejiga. </li><li> Corte un agujero en la vejiga en su parte superior. Hacer el corte entre los vasos para prevenir el sangrado. Introduzca el extremo grande del catéter en la vejiga y el cierre de la sutura sobre el catéter y la vejiga. </li><li> Todos los ratones reciben un bolo de solución de cloruro de sodio al 0,85% en una cantidad igual al 20% del peso corporal. La infusión continua se mantiene a un ritmo de 800ul/h/25g peso corporal y FITC-inulina se agrega a la infusión para la evaluación de la tasa de filtración del riñón entero glomerular (TFG). Después de la estabilización de los animales durante 20 min, 20 min muestras de orina de tiempo se llevan a cabo (cuatro veces) para la determinación de la tasa de flujo urinario y FITC-inulina. La sangre se obtiene en la mitad de cada período de medición de la FITC-inulina. </li><li> Al iniciar el período de recogida de 20 minutos de uso de un temporizador. Recoger la orina colocando el extremo de la sonda vesical en un pequeño tubo eppendorf. Medir el peso del tubo antes y después de la recolección de orina para que pueda determinar la cantidad de orina. Las muestras de sangre se toman a través del formulario de recogida de sangre retroorbital el plexo venoso a través de tubos capilares en el centro de cada período de recolección. </li></ol></li><li> La sangre y el riñón se pueden recoger después de cada procedimiento para más análisis ELISA MPO, por ejemplo, citoquinas EISA, la histología. </li></ol> 3. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2549/2549fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Modelo de un sistema de suspensión de peso para la isquemia renal. Un sistema de peso que cuelga se ha establecido para inducir isquemia renal del riñón izquierdo. Por lo tanto, una sutura de nylon 8,0 se coloca debajo de la arteria renal y al final de cada sutura un peso pequeño (1 g) se adjunta. Este diseño experimental permite la oclusión reversible de la arteria renal mediante la aplicación y la liberación de la carga de peso.

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<li>Joo, J. D., Kim, M., Horst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+delayed+renal+protection+against+renal+ischemia+and+reperfusion+injury+with+A1+adenosine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acute and delayed renal protection against renal ischemia and reperfusion injury with A1 adenosine receptors.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 293, F1847-F1857 (2007).</li>
<li>Grenz, A., Eckle, T., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+hanging-weight+system+for+isolated+renal+artery+occlusion+during+ischemic+preconditioning+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Use of a hanging-weight system for isolated renal artery occlusion during ischemic preconditioning in mice.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 292, F475-F485 (2007).</li>
<li>Qi, Z., Whitt, I., Mehta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+determination+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice+using+FITC-inulin+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 286, 590-596 (2004).</li>
<li>Lorenz, J. N., Gruenstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+nonradioactive+method+for+evaluating+single-nephron+filtration+rate+using+FITC-inulin%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin.</a> Am J Physiol. 276, 172-177 (1999).</li>
<li>Lorenz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+evaluating+cardiovascular%2C+renal%2C+and+pulmonary+function+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282, 1565-1582 (2002).</li>
</ol>

En resumen, el estudio describe una nueva técnica para la realización de la isquemia renal en un modelo murino utilizando un sistema de suspensión de peso para la oclusión de la arteria renal. De hecho, este estudio demuestra una lesión altamente reproducible, lo que reduce la variabilidad asociada con la fijación del pedículo renal.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Pentobarbital sódico </td><td> Ls Vortech Farmacéutica, SA </td><td> VPL 9372 </td><td> 4mg/mL en solución salina </td></tr><tr><td> Sutura de seda 4.0 </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 517698 </td><td></td></tr><tr><td> Sutura de Prolene 8.0 </td><td> Ethicon, EE.UU. </td><td> M8739 </td><td> reutilizables </td></tr><tr><td> microscopio de disección </td><td> Leica </td><td> n / a </td><td> considerar la distancia amplia zona de trabajo </td></tr><tr><td> Calefacción Mesa </td><td> Rt, Effenberger, Alemania </td><td> n / a </td><td> único proveedor y una sola </td></tr><tr><td> Los instrumentos quirúrgicos </td><td> WPI, Dumont </td><td></td><td> una tijera bien microvasos </td></tr></tbody></table>

el uso de un sistema de suspensión de peso para la oclusión de la arteria renal aislada

Use of a Hanging-weight System for Isolated Renal Artery Occlusion

En pacientes hospitalizados, más del 50% de los casos de insuficiencia renal aguda (IRA) son causados ​​por la isquemia renal 1-3. Un estudio reciente de los pacientes hospitalizados reveló que sólo un leve aumento en los niveles de creatinina sérica (0,3 a 0,4 mg / dl) se asocia con un riesgo 70% mayor de muerte que en personas sin ningún tipo de incremento de 1. En este sentido, los procedimientos quirúrgicos que requieren el pinzamiento de la aorta y los vasos renales se asocian con una tasa de fallos renales de hasta un 30% 4. Del mismo modo, la IRA después de la cirugía cardíaca se produce en más del 10% de los pacientes en circunstancias normales y se asocia con un aumento espectacular de la mortalidad. AKI también son complicaciones frecuentes tras el trasplante hepático. Por lo menos 17.8% de los pacientes terminan requiriendo terapia de reemplazo renal 5. Además, la función retardada del injerto debido a una lesión tubular de células durante el trasplante renal es con frecuencia relacionada con la isquemia asociada con lesión renal aguda 6. Por otra parte, la IRA se produce en aproximadamente el 20% de los pacientes con sepsis 6. La aparición de la lesión renal aguda se asocia con un aumento espectacular de la morbilidad y la mortalidad 1. Enfoques terapéuticos son muy limitados y la mayoría de los ensayos de intervención en AKI han fracasado en los seres humanos. Por lo tanto, las modalidades terapéuticas adicionales para prevenir el daño renal por isquemia se necesitan con urgencia 3, 7-9. Para dilucidar los mecanismos de lesión renal por isquemia y posibles estrategias de los modelos murinos terapéuticos son intensamente requeridas 13.07. Modelos de ratón proporcionan la posibilidad de utilizar diferentes modelos genéticos, incluidos los genes específicos ratones y tejidos específicos de genes diana de ratones (CRE-flox del sistema). Sin embargo, la isquemia renal murina es técnicamente difícil y detalles experimentales influyen significativamente en los resultados. Se realizó una evaluación sistemática de un nuevo modelo para la oclusión de la arteria renal aislada en ratones, que específicamente se evita el uso de sujeción o sutura de los 14 pedículo renal. Este modelo requiere de una nefrectomía del riñón derecho ya que la isquemia puede ser realizado en un riñón debido a la configuración experimental. De hecho, mediante el uso de un sistema de suspensión de peso, la arteria renal es sólo una vez instrumentado a través del procedimiento quirúrgico. Además, no hay obstrucción venosa o la uretra se produce con esta técnica. Nosotros pudimos demostrar el tiempo-dependiente de la dosis y altamente reproducible lesiones renales con isquemia mediante la medición de la creatinina sérica. Por otra parte, al comparar este nuevo modelo con sujeción convencional de toda la protección de pedículo renal por precondicionamiento isquémico es más profundo y más confiable. Por lo tanto, su nueva técnica podría ser útil para otros investigadores que trabajan en el campo de la insuficiencia renal aguda.

Un modelo murino precisa para la lesión renal aguda (IRA), debido a la isquemia es una herramienta importante para investigar la lesión renal aguda y, posiblemente, encontrar herramientas terapéuticas para tratar la lesión renal. El sistema de peso que cuelga ofrece una herramienta para la oclusión de la arteria renal inmediata y confiable y la reperfusión, sin causar congestión renal.

El uso de un sistema de suspensión de peso para la oclusión de la arteria renal aislada

En pacientes hospitalizados, más del 50 % de los casos de lesión renal aguda (LRA) son causados por isquemia renal 1-3. Un estudio reciente de pacientes hospitalizados...

El objetivo general de este procedimiento es inducir isquemia en ratones para estudiar la lesión renal aguda. Esto se logra primero mediante la ligadura y luego la extirpación del riñón derecho. El segundo paso consiste en preparar el riñón y colocarlo en una copa de Lucita.A continuación, se aplica un sistema de peso colgante a la arteria renal aislada para inducir isquemia. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran una lesión renal atenuada o severa tras la isquemia, mediante la medición de la función renal a través de la depuración de inulina marcada con FITC. Este sistema de peso colgante para inducir isquemia renal puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la lesión renal aguda y crónica debida a isquemia.El procedimiento será demostrado por Alexander Barla, un estudiante de medicina de la Universidad de Pensilvania, quien se encuentra en nuestro laboratorio para realizar investigación sobre lesión renal este año. Y por Douglas Ard, un asistente de investigación que también trabaja en nuestro grupo. Aunque la isquemia renal puede realizarse simultáneamente en ambos riñones, aquí se demuestra un método más sencillo que consiste en la extirpación del riñón derecho, seguido del tratamiento isquémico del riñón izquierdo remanente.Para comenzar, coloque un animal anestesiado sobre una mesa calentada en posición decúbito lateral izquierdo. Sujete las extremidades inferiores y superiores a la mesa con cinta adhesiva. Limpie la piel y cubra el área de incisión con aceite mineral para prevenir la inhalación de pelo de ratón y reducir la exposición a alérgenos.Realice una incisión sobre el flanco derecho en la piel y corte la pared muscular con un electrodo de coagulación para prevenir sangrado. Ligue el pedículo renal, incluyendo la arteria renal y la vena renal, con una sutura de seda. Use tijeras para extirpar el riñón derecho, teniendo cuidado de no interferir con los vasos adrenales.Utilice suturas para cerrar la pared muscular y luego la piel. Una vez que se cierre la primera herida, coloque al animal en posición decúbito lateral derecho. Realice una incisión sobre el flanco izquierdo y visualice el riñón izquierdo.Separar cuidadosamente el riñón izquierdo de los tejidos conectivos, evitando la glándula suprarrenal y los vasos. El siguiente paso consiste en colocar el riñón sobre su cara ventral en una copa de Lucita. Para ello, sostenga el tejido circundante con pinzas mientras empuja cuidadosamente el polo inferior del riñón dentro de la copa.A continuación, use pinzas para introducir el polo superior del riñón en la copa. Utilice torundas de algodón empapadas con solución salina a 37 grados Celsius para mantener el riñón húmedo y caliente durante todo el procedimiento. Una vez que el riñón esté en la copa, el soporte del riñón se fija ventralmente.Para mantener la tensión sobre los vasos renales, fije el soporte del riñón de manera que la arteria renal pueda identificarse fácilmente encima de la vena renal. Aísle la arteria renal de los tejidos y vasos adyacentes utilizando pinzas finas. Separe cuidadosamente la arteria de la vena que se encuentra debajo.A continuación, coloque una sutura de seda siete cero debajo de la arteria renal utilizando fórceps. Como guía, sujete un peso de aproximadamente un gramo a cada extremo y coloque los extremos de las suturas sobre un pequeño poste. Con los pesos colgando libremente, la arteria renal debe quedar ocluida.La oclusión exitosa se confirma por un cambio de color del rojo al pálido. La duración de la isquemia dependerá del estudio. Aquí, el período isquémico es de 30 minutos tras la isquemia, se retiran los pesos y se permite un tiempo de reperfusión entre 30 y 60 minutos.Después de la reperfusión, libere la tensión del soporte del riñón y mueva suavemente el riñón fuera del recipiente de vuelta al animal. Para determinar el grado de lesión renal, una hora después de la isquemia renal, se puede medir la depuración de inulina marcada con FITC para evaluar la tasa de filtración glomerular. El primer paso consiste en canular la vena yugular izquierda para la infusión continua de cloruro de sodio e inulina marcada con FITC. Después de preparar el animal como se mostró anteriormente, realice una incisión a lo largo del cuello.Aislar la vena de color azul oscuro del tejido circundante. Colocar 2 suturas 4-0 alrededor de la vena aproximadamente a un centímetro de distancia entre sí. Colocar una pinza en la vena antes de la sutura proximal para detener el flujo sanguíneo.A continuación, cierre el nudo distal y coloque un peso en el extremo distal de la sutura para mantener la tensión sobre la vena; use tijeras microquirúrgicas para hacer una pequeña abertura en la vena. Sostenga la abertura con pinzas finas mientras inserta el catéter; retire la pinza para avanzar más el catéter. Una vez en posición, cierre la segunda sutura proximal sobre la vena y el catéter para colocar el catéter vesical destinado a la recogida de orina cronometrada.Primero, corte la piel sobre la vejiga. A continuación, extraiga cuidadosamente la vejiga a través de este orificio. Una vez aislada, sujete la vejiga con tejido húmedo y coloque un trozo de sutura sobre ella.Corte un trozo corto de catéter de 1,5 centímetros y caliente uno de los extremos para suavizar el borde y facilitar la inserción. Coloque una sutura alrededor de la vejiga, luego haga un orificio entre los vasos en la parte superior de la vejiga para prevenir hemorragias. Introduzca el extremo suave del catéter y cierre la sutura sobre el catéter y la vejiga.Ahora que los catéteres están colocados, mantenga una velocidad de infusión continua de 800 microlitros por hora por cada 25 gramos de peso corporal. Se añade inulina marcada con FITC a la infusión para evaluar la tasa de filtración glomerular del riñón completo. Permita que el animal se estabilice durante 20 minutos antes de recoger muestras. En cuatro intervalos de 20 minutos, recoja la orina colocando el extremo del catéter vesical en un pequeño tubo eppendorf.Registre el peso del tubo antes y después de la recopilación. Para determinar la cantidad de orina, obtenga una muestra de sangre mediante la recopilación del plexo venoso retroorbital en la mitad de cada período de tiempo para la medición de la inulina marcada con FITC, como alternativa a la medición de la depuración de inulina mediante cannulación directa; la depuración de creatinina y la creatinina sérica pueden medirse utilizando una jaula metabólica. Después de la recuperación de la lesión renal, el ratón se coloca en jaulas metabólicas para la determinación de la función renal.Parámetros para 24 horas: pese cada botella de agua antes de colocarla en la jaula. Este peso se utilizará posteriormente para determinar la cantidad de agua consumida durante el estudio. Pese las botellas de agua y utilice este peso, restándolo del peso inicial, para determinar la cantidad consumida. La función renal puede evaluarse midiendo los niveles plasmáticos y urinarios de creatinina, sodio y potasio en diferentes momentos tras la isquemia.Tras seguir este procedimiento, se pueden medir los niveles de citocinas para revelar el grado de inflamación tras la isquemia aguda de riñón.

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