Name: Perfiles de microARN de alto rendimiento: Multiplex Optimizado QRT-PCR en la escala de nanolitros de la IFC Fluidigm dinámica ArrayTM (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Aprende a perfilar microARN mediante qRT-PCR multiplex optimizado en plataforma microfluídica. Este método permite analizar 384 microARN con alta precisión y reproducibilidad usando cantidades mínimas de ARN.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nos gustaría dar las gracias al laboratorio Blelloch para comentar sobre el texto. Este trabajo fue apoyado por fondos de RB de los NIH (K08 NS48118 y NS057221 R01), California Institute of Medicina Regenerativa (CIRM) (semillas subvención RS1-00161, Premio Nueva Facultad RN2-00906) y el Pew Charitable Trust y de la FM wissenschaftlich Urologische Gesellschaft eV.

<ol><li>Mitchell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10513-10518 (2008).</li>
<li>Tang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((220-plex+microRNA+expression+profile+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">220-plex microRNA expression profile of a single cell.</a> Nat Protoc. 1, 1154-1159 (2006).</li>
<li>Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGertsenstein%2C+M+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 644-645 (2003).</li>
<li>Suh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+function+is+globally+suppressed+in+mouse+oocytes+and+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA function is globally suppressed in mouse oocytes and early embryos.</a> Curr Biol. 20, 271-277 (2010).</li>
<li>Babiarz, J. E., Ruby, J. G., Wang, Y., Bartel, D. P., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+ES+cells+express+endogenous+shRNAs%2C+siRNAs%2C+and+other+Microprocessor-independent%2C+Dicer-dependent+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mouse ES cells express endogenous shRNAs, siRNAs, and other Microprocessor-independent, Dicer-dependent small RNAs.</a> Genes Dev. 22, 2773-2785 (2008).</li>
<li>Babiarz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNAs%3A+their+biogenesis%2C+regulation+and+function+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22StemBook%22%5BJournal%5D)">Small RNAs: their biogenesis, regulation and function in embryonic stem cells.</a> StemBook. , (2009).</li>
<li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2008).</li>
<li>Wang, Y., Medvid, R., Melton, C., Jaenisch, R., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DGCR8+is+essential+for+microRNA+biogenesis+and+silencing+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nat Genet. 39, 380-385 (2007).</li>
<li>Kanellopoulou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer-deficient+mouse+embryonic+stem+cells+are+defective+in+differentiation+and+centromeric+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing.</a> Genes Dev. 19, 489-501 (2005).</li>
<li>Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+custom+microarray+platform+for+analysis+of+microRNA+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression.</a> Nat Methods. 1, 47-53 (2004).</li>
<li>Moltzahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+based+multiplex+qRT-PCR+identifies+diagnostic+and+prognostic+microRNA+signatures+in+sera+of+prostate+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Microfluidic based multiplex qRT-PCR identifies diagnostic and prognostic microRNA signatures in sera of prostate cancer patients.</a> Cancer Res. 71, 550-560 (2011).</li>
<li>Mestdagh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biol. 10, R64-R64 (2009).</li>
</ol>

Alan Mir es un empleado de la Corporación Fluidigm. De lo contrario, no tengan intereses financieros de revelar.

miRNAs son cortas (18-24 nucleótidos), no codificantes miARN ARN que regulan la expresión de genes post-transcripcional por dos moléculas de ARN mensajero de desestabilización (ARNm) y la inhibición de su traducción. 6 El hecho de que al menos un tercio de los genes humanos contienen conserva vinculantes en sus sitios 3&#39;UTR y las interacciones evidentes de miRNAs con genes para la proliferación de pluripotencia y la apoptosis sugiere una contribución decisiva en las decisiones del destino celular, la homeostasis de los tejidos y enfermedades como el cáncer. 6,7 perfiles de microARN Por lo tanto precisa de expresión son de amplio de interés. Para probar el multiplex publicado QRT-PCR la expresión miARN perfiles de protocolo 2 se utilizó ARN pequeños MESC deficiente como controles negativos. DGCR8 - / - las células son deficientes de todos los microARN canónica, mientras que Dicer - / -. MicoRNAs células carecen de los canónicos y no-canoncial 8,9 Al comparar los niveles de tipo salvaje economía de mercado a DGCR8 - / - las células, hemos descubierto la falta de precisión ya que varios expresaron 10 microARN no se detectaron en las células de tipo salvaje 11. Algunos incluso mostraron menores niveles de expresión en relación con las células de apoyo (Figura 3a). La hipótesis de que la falta de precisión puede ser causado por el primer gran aporte de los dos pasos consecutivos multiplex (RT-PCR y Pre) antes de singleplex RT-cuantificación. Sin embargo, la pre-amplificación multiplex es necesario para mejorar la potencia de la señal, sobre todo cuando la concentración inicial de ARN es limitado. Mediante la purificación de distancia pre-PCR de los cebadores de selección de tamaño en geles de poliacrilamida nativos (Figura 2), hemos podido demostrar una mejora sustancial en la precisión de la detección de más microARN y una pérdida de señales de falsos positivos, tanto en DGCR8 - / - y Dicer - / - Fondos (Figuras 3a y 3b) Además de la modificación de QRT-PCR enfoque permitió la clasificación adecuada de rara DGCR8 independiente / dependiente de ARN Dicer pequeñas (Figura 3b) 11. Por lo tanto, un paso adicional para purificar primers excesiva lejos de pre-PCR producto es claramente ventajoso, especialmente cuando se utilizan grandes conjuntos de imprimación multiplex por muestra. El número óptimo de ciclos de amplificación pre-viene determinada por la concentración de entrada del ARN. El saldo que no en-o overamplify debe guiarse por los datos relativos a la experiencia específica. Con más de un millar de microARNs conocidos, el uso de la norma 384-y las placas pueden no ser óptimos para crear perfiles de microARN extensa, especialmente cuando se comparan varias muestras. La IFC Fluidigm matriz dinámica permite, con una disminución significativa de los pasos de pipeteado y la química necesaria, las pruebas de hasta 96 muestras individuales en contra de 96 microARN diferentes en un solo experimento (9216 reacciones) a escala de nanolitros (6,7 nL). Para cada ejecución del software de análisis proporciona curvas de amplificación, un código de colores mapas de calor y los valores umbral del ciclo (Ct). La simultánea a gran escala de perfiles reduce las variaciones experimentales y permite la normalización de valor medio de expresión, que supera a otras estrategias de normalización que hacen uso de pequeños controles de ARN 12. En comparación con los disponibles en el mercado 384 plataformas y con pre-asignado sondas TaqMan, la combinación de una plataforma de perfiles de alto rendimiento con juegos de cebadores a medida ofrece flexibilidad experimental de alta. El multiplex optimizado QRT-PCR enfoque en combinación con la plataforma de matriz dinámica nos ha permitido con éxito a la pantalla al mismo tiempo el cáncer de próstata 48 sueros de pacientes de alteraciones en los niveles de miRNA 384 (Figura 4) y para normalizar los datos, sin aumento en los controles (es decir, sintéticos microRNAs). 11 A pesar del aumento de los pasos desde la preparación de las muestras con los resultados de perfiles, el enfoque descrito es un tiempo y coste-efectivo método de alto perfil de grandes conjuntos de muestras de los niveles de expresión de miRNA, incluso con material de partida limitada.

perfiles de microarn de alto rendimiento: multiplex optimizado qrt-pcr en la escala de nanolitros de la ifc fluidigm dinámica arraytm

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

La amplia participación de los miRNAs en los procesos críticos que subyacen al desarrollo, el tejido de la homeostasis y la enfermedad ha llevado a un creciente interés entre las comunidades científicas y farmacéuticas. Para el estudio de miRNAs, es esencial que la cuantificación de los niveles de microARN es preciso y robusto. Mediante la comparación de tipo salvaje a los pequeños ARN células madre embrionarias de ratón deficiente (MESC), que reveló una falta de precisión y solidez en el anterior, publicado QRT-PCR multiplex técnicas. Aquí se describe un método optimizado, incluyendo purificación de distancia excesiva de primers multiplex pasos previos antes de la detección singleplex tiempo real, lo cual incrementa la precisión y robustez de la técnica. Además, se explica cómo realizar la técnica en un chip de microfluidos en volúmenes nanolitros reduce significativamente los costos de reactivos y el tiempo lo permite eficaz miRNA de alto rendimiento de perfiles de expresión.

A continuación se describe un reverso transcriptasa optimizado multiplex PCR cuantitativa (QRT-PCR) en combinación con el protocolo de una plataforma de microfluidos como un costo y el tiempo efectivo instrumento de cribado de alto rendimiento para los microRNA (miRNA) los niveles de expresión, especialmente cuando se trabaja con cantidades limitadas de muestras.

Perfiles de microARN de alto rendimiento: Multiplex Optimizado QRT-PCR en la escala de nanolitros de la IFC Fluidigm dinámica ArrayTM

La amplia implicación de los miARN en procesos críticos que subyacen al desarrollo, la homeostasis tisular y la enfermedad ha generado un creciente interés entre los...

El objetivo general de este procedimiento es analizar eficazmente la expresión de microARN, de forma económica y con una cantidad mínima de material inicial, combinando la R-T-P-C-R cuantitativa multiplex con una plataforma microfluídica. Esto comienza con la concentración del ARN extraído, seguido de la transcripción inversa multiplex y la preamplificación multiplex. El siguiente paso consiste en purificar y eliminar los cebadores en exceso.Finalmente, se realiza el perfilado de la expresión de microARN en modo uniplex utilizando una plataforma microfluídica. El resultado son niveles de expresión de microARN precisos y altamente reproducibles entre muestras de interés. La ventaja principal de esta técnica frente a los métodos existentes es que el paso adicional de purificación tras la amplificación previa a EMP mejora la precisión y reproducibilidad del método de Q-R-T-P-C-R multiplex.Comience con ARN extraído de suero. Utilizando un kit de purificación de ARN o un método de ARN basado en fenol-cloroformo a partir de tejido homogeneizado como triol, todas las extracciones deben incluir un paso de lavado, y todo el almacenamiento se realiza a menos 80 grados Celsius. Concentre la solución de ARN.Si se comienza con una cantidad limitada de muestra, como suero en primer lugar, inserte un depósito de muestra MicroCon en un vial y luego pipetee la solución de ARN en el depósito, teniendo mucho cuidado de no tocar la membrana con la punta de la pipeta. A continuación, coloque el vial y el filtro en la centrífuga con la banda de marca orientada hacia el rotor y realice la centrifugación durante aproximadamente tres horas. Después de tres horas, el ARN estará completamente concentrado en la membrana para eluir el ARN.Agregue una cantidad deseada de agua libre de ARN a la membrana, invierta el depósito y colóquelo en un nuevo vial. Luego, centrifugue durante tres minutos a cuatro grados Celsius con un máximo de 3000 ×g. Almacene el ARN concentrado a menos 80 grados Celsius hasta que sea necesario. Después de realizar una reacción de RT sobre el ARN utilizando cebadores inversos en bucle de palanca xpl, seguida de 12 a 18 ciclos de PCR, los microARN están representados por cadenas de ADNc.Esto se denomina producto pre-PCR. En referencia al QPCR próximo. El producto pre-PCR debe purificarse en un gel de poliacrilamido al 10 % junto con un marcador de ADN de 10 pares de bases, cargando cada pozo con 5,5 microlitros de naranja G al seis por ciento combinados con 27,5 microlitros del producto pre-PCR.Corra el gel a 150 voltios durante 55 a 60 minutos. El azul de romofenol corre en este gel en la región de 20 pares de bases. Después de correr el gel, tiña con oro ciberético durante 25 minutos, sin exposición a la luz y en agitación a partir del gel teñido.Recorte la banda del producto previo a la PCR de 60 a 80 pares de bases y transfiera el bloque de gel a tubos etiquetados. Si la concentración del producto es baja, podría no ser visible, pero aún así estará presente en el gel. A continuación, triture la banda de gel mediante centrifugación con tubo dentro de tubo y agregue 300 microlitros de tampón TEN.Incube la mezcla de gel tampón durante cuatro horas a 37 grados Celsius con agitación. Después de cuatro horas, transfiera el líquido a un nuevo tubo y agregue 300 microlitros adicionales de tampón TEN. Incube esta mezcla durante la noche a cuatro grados Celsius con agitación.Al día siguiente, transfiera nuevamente el contenido del tubo y continúe con una precipitación con etanol del producto previo a la PCR. Cuando se abre un chip desde su envase, debe cebado dentro de las 24 horas y luego cargado dentro de los 60 minutos posteriores al cebado. Comience el cebado del arreglo inyectando 150 microlitros de fluido de línea de control en cada uno de los acumuladores del chip.Tenga cuidado de no derramar ningún líquido sobre el chip ni en las entradas, ya que el chip se volverá inutilizable. Luego, coloque el chip en el circuito fluidico integrado o controlador IFC y ejecute el script de cebado del controlador. Tan pronto como comience el programa, inicie la preparación de las muestras.Comience preparando la mezcla de muestra pres. Combine tack man, mezcla maestra universal y reactivos de carga. Luego, utilizando el formato de carga de 96 pocillos, mezcle 2,25 microlitros de cada muestra con 2,75 microlitros de la mezcla de muestra pres para recoger el líquido cargado. Vortex brevemente y centrifugue rápidamente la placa a cuatro grados Celsius.La placa de muestra ya está preparada. Ahora utilice una nueva placa de 96 pocillos para preparar concentraciones 13 x de la mezcla de ensayo. Esto se realiza mezclando un cebador universal, un cebador directo y una sonda específica del gen tac man por pocillo.Las concentraciones de X son de un micromolar para el cebador universal y el cebador directo, y de 0,2 micromolar para la sonda TaqMan. A continuación, añada suficiente Tween para obtener una concentración final de 0,25 % de Tween en un volumen final por pocillo de cinco microlitros. Mezcle bien evitando burbujas y centrifugue brevemente la placa para recoger el líquido.Esta es la placa de ensayo. Inicie la Q-R-T-P-C-R 96.96 cargando el chip. Primero cargue las muestras y luego los ensayos, con un volumen final de cinco microlitros por entrada en el IFC.En segundo lugar, ejecute el script de mezcla de carga para cargar las muestras y los ensayos en el chip. Cuando finalice el script, retire la película protectora del chip cargado y elimine cualquier partícula de polvo o residuo de la superficie del chip utilizando cinta adhesiva. Ahora configure el programa de amplificación del sistema biológico.Cargue el chip en el sistema y ejecute el programa. Los resultados pueden analizarse con el software fluid dime para obtener curvas de amplificación, mapas térmicos completos del chip y valores de CT para cada uno. Pozo utilizando productos pre-PCR, purificados por separación por tamaño en geles nativos de poliacrilamida, DGCR8 de tipo silvestre y mutante nulo de ER.El ARN se preparó en comparación con protocolos previos. Ocurren más microARNs y una pérdida de señales falsas positivas en ambos fondos nulos de DGCR ocho y nulos de ER gracias al paso de purificación. Además, el enfoque modificado de QR TPCR R permite la categorización adecuada de raros ARN pequeños independientes de D gcr ocho y dependientes de Dicer.Aquí, se analizaron 48 ceras de pacientes y controles para detectar cambios en la expresión de 384 microARNs diferentes. Los datos se normalizaron para cada muestra restando la mediana correspondiente y sin utilizar un control de referencia. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo la Q-R-T-P-C-R múltiple en una plataforma de flujo puede utilizarse para perfilar simultáneamente cientos de microARNs en muchas muestras, incluso cuando se parte de una cantidad muy limitada de ARN inicial.

high-throughput-microrna-profiling-optimized-multiplex-qrt-pcr-at

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Vamos a demostrar la configuración y el análisis de pre-microRNA-96 y las matrices de QPCR utilizando un robot, así como con la mano con una pipeta de Thermo Scientific multicanal Matrix.

Perfiles de Pre-micro ARN y microRNAs utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) Arrays

La presencia de microRNAs estables (miRNAs) en exosomas ha generado gran interés como un nuevo modo de comunicación intercelular, por su utilidad potencial como marcadores biológicos y como una ruta para la intervención terapéutica. Aquí se demuestra la purificación de exosomas sanguíneos y medios de cultivo seguido de PCR cuantitativa para identificar miRNAs que se transportan.

Purificación y microRNA perfiles de exosomas derivados de la sangre y Cultura Medios

Se describe un protocolo de PCR en tiempo real para perfilar microRNAs en el líquido cefalorraquídeo (LCR). Con la excepción de los protocolos de extracción de ARN, el procedimiento se puede extender a ARN extraído de otros fluidos corporales, células cultivadas o muestras de tejido.

Líquido cefalorraquídeo MicroRNA perfiles utilizando cuantitativa en tiempo real PCR

Molecular señalización a través de estrógeno y microRNAs son fundamentales en el desarrollo y el crecimiento del cáncer de mama. El estrógeno activa los receptores de estrógeno, que son factores de transcripción. Muchos factores de transcripción pueden regular la expresión de microRNAs, y microARN regulados por estrógenos se puede perfilar el uso de diferentes técnicas a gran escala.

Perfiles de microARN regulados por estrógeno en las células del cáncer de mama

MicroRNAs circulantes han surgido recientemente como biomarcadores prometedores y novedosos para varios tipos de cáncer y otras enfermedades. El objetivo de este artículo es discutir tres plataformas basados ​​en sondas diferentes en tiempo real PCR y métodos que están disponibles para cuantificar y determinar la abundancia de microRNAs en circulación.

PCR en tiempo real basada en sondeos Enfoques para la medición cuantitativa de microRNAs

Describimos el uso de una plataforma de expresión génica multiplexada de alto rendimiento que cuantifica la expresión génica mediante códigos de barras y recuento de moléculas en sustratos biológicos sin necesidad de amplificación. Utilizamos la plataforma para cuantificar la expresión de microARN (miARN) en sangre total en sujetos con y sin síndrome de intestino irritable.

Las perturbaciones de circulación miRNAs en el Síndrome del Intestino Irritable detectó utilizando una plataforma de expresión de genes de multiplexado de alto rendimiento

pruebas de alto rendimiento de ADN y ARN patógenos basados ​​por nanoescala PCR se describe el uso de un canino sindrómica y el panel de PCR respiratoria equina.

La detección de alto rendimiento de los patógenos respiratorios de especímenes animales por PCR nanoescala

Este protocolo describe la forma de evaluar la expresión de una gran variedad de genes a nivel clonal. Una sola célula de RT-qPCR produce resultados altamente fiables con una fuerte sensibilidad para cientos de muestras y los genes.

Una sola célula de la expresión génica utilizando multiplex RT-qPCR para caracterizar heterogeneidad de las poblaciones linfoides Raras

Describimos un método para clasificar células individuales de mamíferos y cuantificar la expresión de hasta 96 genes diana de interés en cada célula. Este método incluye el uso de estándares internos de qPCR para permitir la estimación de recuentos absolutos de transcripciones.

Una sola célula de perfiles de expresión génica El uso de FACS y qPCR con las Normas Internas

Aquí, se presenta un protocolo cuantitativo en tiempo real basado en la reacción en cadena de la polimerasa para la determinación del contenido nativo de microARN (absoluto/relativo) de las partículas de lipoproteína. Además, se demuestra un método para aumentar el nivel de microARN, así como un método para determinar la tasa de captación celular de las partículas de lipoproteínas.

Enriquecimiento de partículas de lipoproteínas nativas con microRNA y determinación posterior de su contenido absoluto/relativo de microRNA y su tasa de transferencia celular

En este artículo se describe un protocolo de alto rendimiento para una determinación rápida y confiable de los niveles de expresión génica en muestras de C. elegans simples o masivas. Este protocolo no requiere aislamiento de ARN y produce cDNA directamente a partir de muestras. Se puede utilizar junto con plataformas qPCR nanofluídicas nanofluídicas multiplexadas de alto rendimiento en tiempo real.

RT-PCR cuantitativo de alto rendimiento en muestras de C. elegans individuales y a granel utilizando tecnología nanofluídica

Aprende a perfilar microARN mediante qRT-PCR multiplex optimizado en plataforma microfluídica. Este método permite analizar 384 microARN con alta precisión y reproducibilidad usando cantidades mínimas de ARN.

Perfiles de microARN de alto rendimiento: Multiplex Optimizado QRT-PCR en la escala de nanolitros de la IFC Fluidigm dinámica ArrayTM (Video) | JoVE Journal

Perfiles de microARN de alto rendimiento: Multiplex Optimizado QRT-PCR en la escala de nanolitros de la IFC Fluidigm dinámica ArrayTM

Explorar más videos