Perfiles de microARN de alto rendimiento: Multiplex Optimizado QRT-PCR en la escala de nanolitros de la IFC Fluidigm dinámica ArrayTM

El objetivo general de este procedimiento es analizar eficazmente la expresión de microARN, de forma económica y con una cantidad mínima de material inicial, combinando la R-T-P-C-R cuantitativa multiplex con una plataforma microfluídica. Esto comienza con la concentración del ARN extraído, seguido de la transcripción inversa multiplex y la preamplificación multiplex. El siguiente paso consiste en purificar y eliminar los cebadores en exceso.

Finalmente, se realiza el perfilado de la expresión de microARN en modo uniplex utilizando una plataforma microfluídica. El resultado son niveles de expresión de microARN precisos y altamente reproducibles entre muestras de interés. La ventaja principal de esta técnica frente a los métodos existentes es que el paso adicional de purificación tras la amplificación previa a EMP mejora la precisión y reproducibilidad del método de Q-R-T-P-C-R multiplex.

Comience con ARN extraído de suero. Utilizando un kit de purificación de ARN o un método de ARN basado en fenol-cloroformo a partir de tejido homogeneizado como triol, todas las extracciones deben incluir un paso de lavado, y todo el almacenamiento se realiza a menos 80 grados Celsius. Concentre la solución de ARN.

Si se comienza con una cantidad limitada de muestra, como suero en primer lugar, inserte un depósito de muestra MicroCon en un vial y luego pipetee la solución de ARN en el depósito, teniendo mucho cuidado de no tocar la membrana con la punta de la pipeta. A continuación, coloque el vial y el filtro en la centrífuga con la banda de marca orientada hacia el rotor y realice la centrifugación durante aproximadamente tres horas. Después de tres horas, el ARN estará completamente concentrado en la membrana para eluir el ARN.

Agregue una cantidad deseada de agua libre de ARN a la membrana, invierta el depósito y colóquelo en un nuevo vial. Luego, centrifugue durante tres minutos a cuatro grados Celsius con un máximo de 3000 ×g. Almacene el ARN concentrado a menos 80 grados Celsius hasta que sea necesario. Después de realizar una reacción de RT sobre el ARN utilizando cebadores inversos en bucle de palanca xpl, seguida de 12 a 18 ciclos de PCR, los microARN están representados por cadenas de ADNc.

Esto se denomina producto pre-PCR. En referencia al QPCR próximo. El producto pre-PCR debe purificarse en un gel de poliacrilamido al 10 % junto con un marcador de ADN de 10 pares de bases, cargando cada pozo con 5,5 microlitros de naranja G al seis por ciento combinados con 27,5 microlitros del producto pre-PCR.

Corra el gel a 150 voltios durante 55 a 60 minutos. El azul de romofenol corre en este gel en la región de 20 pares de bases. Después de correr el gel, tiña con oro ciberético durante 25 minutos, sin exposición a la luz y en agitación a partir del gel teñido.

Recorte la banda del producto previo a la PCR de 60 a 80 pares de bases y transfiera el bloque de gel a tubos etiquetados. Si la concentración del producto es baja, podría no ser visible, pero aún así estará presente en el gel. A continuación, triture la banda de gel mediante centrifugación con tubo dentro de tubo y agregue 300 microlitros de tampón TEN.

Incube la mezcla de gel tampón durante cuatro horas a 37 grados Celsius con agitación. Después de cuatro horas, transfiera el líquido a un nuevo tubo y agregue 300 microlitros adicionales de tampón TEN. Incube esta mezcla durante la noche a cuatro grados Celsius con agitación.

Al día siguiente, transfiera nuevamente el contenido del tubo y continúe con una precipitación con etanol del producto previo a la PCR. Cuando se abre un chip desde su envase, debe cebado dentro de las 24 horas y luego cargado dentro de los 60 minutos posteriores al cebado. Comience el cebado del arreglo inyectando 150 microlitros de fluido de línea de control en cada uno de los acumuladores del chip.

Tenga cuidado de no derramar ningún líquido sobre el chip ni en las entradas, ya que el chip se volverá inutilizable. Luego, coloque el chip en el circuito fluidico integrado o controlador IFC y ejecute el script de cebado del controlador. Tan pronto como comience el programa, inicie la preparación de las muestras.

Comience preparando la mezcla de muestra pres. Combine tack man, mezcla maestra universal y reactivos de carga. Luego, utilizando el formato de carga de 96 pocillos, mezcle 2,25 microlitros de cada muestra con 2,75 microlitros de la mezcla de muestra pres para recoger el líquido cargado. Vortex brevemente y centrifugue rápidamente la placa a cuatro grados Celsius.

La placa de muestra ya está preparada. Ahora utilice una nueva placa de 96 pocillos para preparar concentraciones 13 x de la mezcla de ensayo. Esto se realiza mezclando un cebador universal, un cebador directo y una sonda específica del gen tac man por pocillo.

Las concentraciones de X son de un micromolar para el cebador universal y el cebador directo, y de 0,2 micromolar para la sonda TaqMan. A continuación, añada suficiente Tween para obtener una concentración final de 0,25 % de Tween en un volumen final por pocillo de cinco microlitros. Mezcle bien evitando burbujas y centrifugue brevemente la placa para recoger el líquido.

Esta es la placa de ensayo. Inicie la Q-R-T-P-C-R 96.96 cargando el chip. Primero cargue las muestras y luego los ensayos, con un volumen final de cinco microlitros por entrada en el IFC.

En segundo lugar, ejecute el script de mezcla de carga para cargar las muestras y los ensayos en el chip. Cuando finalice el script, retire la película protectora del chip cargado y elimine cualquier partícula de polvo o residuo de la superficie del chip utilizando cinta adhesiva. Ahora configure el programa de amplificación del sistema biológico.

Cargue el chip en el sistema y ejecute el programa. Los resultados pueden analizarse con el software fluid dime para obtener curvas de amplificación, mapas térmicos completos del chip y valores de CT para cada uno. Pozo utilizando productos pre-PCR, purificados por separación por tamaño en geles nativos de poliacrilamida, DGCR8 de tipo silvestre y mutante nulo de ER.

El ARN se preparó en comparación con protocolos previos. Ocurren más microARNs y una pérdida de señales falsas positivas en ambos fondos nulos de DGCR ocho y nulos de ER gracias al paso de purificación. Además, el enfoque modificado de QR TPCR R permite la categorización adecuada de raros ARN pequeños independientes de D gcr ocho y dependientes de Dicer.

Aquí, se analizaron 48 ceras de pacientes y controles para detectar cambios en la expresión de 384 microARNs diferentes. Los datos se normalizaron para cada muestra restando la mediana correspondiente y sin utilizar un control de referencia. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo la Q-R-T-P-C-R múltiple en una plataforma de flujo puede utilizarse para perfilar simultáneamente cientos de microARNs en muchas muestras, incluso cuando se parte de una cantidad muy limitada de ARN inicial.