Perfiles de microARN de alto rendimiento: Multiplex Optimizado QRT-PCR en la escala de nanolitros de la IFC Fluidigm dinámica ArrayTM

El objetivo general de este procedimiento es perfilar la expresión de micro ARN de manera eficiente, económica y con un mínimo de material de partida mediante la combinación de R-T-P-C-R cuantitativo múltiple con una plataforma microfluídica. Esto comienza con la concentración del ARN extraído, seguido de la transcripción inversa multiplex y la preamplificación multiplex. El siguiente paso es purificar el exceso de imprimaciones.

Por último, se perfila la expresión de micro ARN singleplex utilizando una plataforma microfluídica. El resultado son niveles de expresión de microARN precisos y altamente reproducibles en todas las muestras de interés. La principal ventaja de esta técnica de los métodos existentes es que el paso de purificación adicional después de la amplificación pre-EMP mejora la precisión y la reproducibilidad del método multiplex Q-R-T-P-C-R.

Comience con el ARN que se ha extraído del suero. Utilizando un kit de purificación de ARN o un método de ARN basado en cloroformo de fenol a partir de tejido homogeneizado como el triol, todas las extracciones deben seguirse con un paso de lavado y todo el almacenamiento se realiza a menos 80 grados centígrados. Concentra la solución de ARN.

Si comienza con una cantidad limitada de muestra, como de suero primero, inserte un depósito de muestra MicroCon en un vial, luego pipetee la solución de ARN en el depósito, teniendo mucho cuidado de no tocar la membrana con la punta de la pipeta. Ahora coloque el vial y el filtro en la centrífuga con la banda de craqueo hacia el rotor y haga funcionar la centrifugación durante unas tres horas. Después de tres horas, el ARN estará completamente concentrado en la membrana para eluir el ARN.

Agregue la cantidad deseada de agua libre de ARN a la membrana, invierta el depósito y colóquelo en un nuevo vial. Luego gire durante tres minutos a cuatro grados Celsius con un máximo de 3000 veces G.Store el ARN concentrado a menos 80 grados Celsius hasta que sea necesario Después de realizar una reacción RT en el ARN usando cebadores de bucle de tallo inverso xpl, seguido de 12 a 18 rondas de ciclos de PCR. Los microARN están representados por hebras de CD NA.

A esto se le llama producto pre PCR. Refiriéndose a la próxima QPCR. El producto de pre PCR debe purificarse en un gel de poliacrilamida al 10% junto con una escalera de ADN emparejada de 10 bases en cada carril con 5,5 microlitros de seis x G naranja combinados con 27,5 microlitros de producto de pre PCR.

Haga funcionar el gel a 150 voltios durante 55 a 60 minutos. El azul de fenol de Romo se ejecuta en este gel en la región de 20 pares de bases. Después de que el gel haya fluido, tiñe con cyber gold durante 25 minutos, sin exponerlo a la luz y en una coctelera del gel manchado.

Corte la banda del producto pre PCR de 60 a 80 pares de bases y transfiera el bloque de gel a los tubos etiquetados. Si la concentración del producto es baja, es posible que no sea visible, pero aún estará en el gel. Ahora triture la banda de gel usando un tubo en la centrifugación del tubo y agregue 300 microlitros de tampón TEN.

Incubar la mezcla de gel tampón durante cuatro horas a 37 grados centígrados con agitación. Después de cuatro horas, transfiera el líquido a un nuevo tubo y agregue 300 microlitros más de tampón TEN. Incubar esta mezcla durante la noche a cuatro grados centígrados con agitación.

Al día siguiente, vuelva a transferir el contenido del tubo y proceda a una precipitación en etanol del producto pre PCR. Cuando se abre un chip de su paquete, debe cebarse dentro de las 24 horas y luego cargarse dentro de los 60 minutos posteriores al cebado. Comience a cebar la matriz inyectando 150 microlitros de fluido de línea de control en cada uno de los acumuladores del chip.

Tenga cuidado de no derramar ningún líquido sobre el chip o las entradas, o el chip quedará inutilizable. A continuación, coloque el chip en el circuito fluídico integrado o en el controlador IFC y ejecute el script de cebado del controlador. Tan pronto como comience el programa, comience a preparar las muestras.

Comience preparando la muestra pres Mezcle una combinación de hombre de tachuelas, mezcla maestra universal y reactivos de carga. Luego, usando el formato de carga de 96 pocillos, combine 2.25 microlitros de cada muestra con 2.75 microlitros de mezcla de muestra previa para recolectar el fluido cargado. Realice un vórtice breve y centrifuga rápidamente la placa a cuatro grados centígrados.

La placa de muestra ya está preparada. Ahora utilice una nueva placa de 96 pocillos para preparar concentraciones 13 x de la mezcla de ensayo. Esto se hace mezclando un cebador universal, un cebador directo y una sonda de tacto man específica de genes por pocillo.

Las concentraciones de un X son un micromolar para el cebador universal y directo y 0,2 micromolar para la sonda tac man. A continuación, añada suficiente interpolación para obtener una concentración final de 0,25% de interpolación en un volumen final de pocillo de cinco microlitros. Mezclar bien evitando burbujas y girar brevemente el plato para recoger el líquido.

Esta es la placa de ensayo. Comience el 96.96 Q-R-T-P-C-R cargando el chip. Primero cargue las muestras y luego los ensayos con el volumen final de cinco microlitros por entrada al IFC.

En segundo lugar, ejecute el script de mezcla de carga para cargar las muestras y los ensayos en el chip. Cuando termine el guión, retire la película protectora del chip cargado y elimine cualquier partícula de polvo o residuo de la superficie del chip con cinta adhesiva. Ahora configure el programa de amplificación del biosistema.

Cargue el chip en el sistema y ejecute el programa. Los resultados se pueden analizar con un software de diez centavos para proporcionar curvas de amplificación, mapas de calor de todo el chip y valores de CT para cada uno. Bien utilizando productos pre PCR, purificados por separación de tamaño en geles de poliacrilamida nativos, tipo salvaje DG CR eight y mutante nulo ER.

El ARN se preparó en comparación con los protocolos anteriores. Se producen más microARN y una pérdida de señales de falsos positivos tanto en el fondo nulo de DGCR ocho como en el fondo nulo de ER gracias a la etapa de purificación. Además, el enfoque QR TPCR R modificado permite la categorización adecuada de los ARN pequeños dependientes de D gcr ocho dubicadores independientes raros.

Aquí, se examinaron 48 ceras de pacientes y controles para detectar cambios en la expresión de 384 microARN diferentes. Los datos se normalizaron para cada muestra restando la mediana correspondiente y sin utilizar un pico en los controles. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo se puede usar Q-R-T-P-C-R multiplex en una plataforma de línea de gripe para perfilar simultáneamente cientos de micronasas en muchas muestras, incluso cuando se comienza con una entrada muy limitada, ARN.