Name: Xenotrasplante ortotópico de los Derechos Humanos-luciferasa Tagged células malignas del tumor vaina de nervio periférico para In vivo Pruebas de candidatos a agentes terapéuticos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Aprende a realizar xenotrasplante ortotópico de células de tumor maligno de vaina de nervio periférico marcadas con luciferasa en ratones inmunodeficientes. Este método permite evaluar agentes terapéuticos mediante imagen de bioluminiscencia in vivo.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas e Ictus (R01 NS048353 a SLC), el Instituto Nacional del Cáncer (R01 CA122804 a SLC, R01 CA134773 a Kevin A. Roth y SLC y CA13148-35 a KRZ) y el Departamento de Defensa (X81XWH-09-1-0086 a SLC). Fondos de apoyo a la operación de los pequeños del Centro Integral del Cáncer de la UAB instalación de imágenes de animales compartidos fueron proporcionados por un núcleo de apoyo NCI subvención (P30 CA13148-35, E. Partridge, PI). Agradecemos a la Neurociencia Alabama Plan Core Center (P30 NS57098) y Neurociencia de la UAB Core Center (P30 NS47466) por su ayuda. El contenido es responsabilidad exclusiva de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud o el Departamento de Defensa.

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El método detallado ortotópico xenoinjertos se presenta aquí es que hemos desarrollado con ST88-14 células MPNST, una línea que es ampliamente utilizado en los estudios de estos NF1 tumores asociados de vaina nerviosa periférica. Sin embargo, esta metodología es fácilmente adaptable a los estudios preclínicos con otras líneas de células MPNST. Por ejemplo, también hemos realizado ortotópico xenoinjertos con la misión STS-26T 10 células, una línea derivada de una aparición esporádica MPNST y T265-2c células 11, que se derivan de un MPNST NF1 asociados, con un éxito similar al que observamos con ST88 -14 células. Dicho esto, cabe señalar que las condiciones exactas que describimos aquí para ortotópico xenoinjertos de ST88-14 células no pueden ser adoptadas directamente por el injerto de las líneas de MPNST otros. En cambio, los parámetros clave de la metodología debe ser determinada empíricamente para cada línea celular. Estos parámetros incluyen el número de células MPNST inicialmente el injerto en el tiempo permitido para el desarrollo del injerto y, en menor medida, el volumen en el que las células tumorales se inyectan. Para establecer estos parámetros para una nueva línea, que los grupos de injerto de ratones (5 ratones por grupo) con 10 3 a 5 x 10 6 células tumorales, el control de las concentraciones de dos células de cada orden de magnitud (es decir, 10 3 células, 5 x 10 3 células, 10 4 células, 5 x 10 4 células, etc.) Un mayor número de células tumorales (&gt; 10 6) se debe inyectar en un volumen mayor, hemos encontrado que hasta un 5 ml se puede inyectar sin pérdida de las células del nervio injertado. También hemos encontrado que no más de 5 x 10 6 células tumorales por volumen de 5 ml se puede inyectar en forma de suspensiones más denso cada vez más propensos a la corte que mata las células tumorales. Seguimos estos ratones hasta por lo menos tres animales en cada grupo tienen tumores palpables, momento en el que damos por terminado ese grupo y examinar el nervio histológico para confirmar el crecimiento del injerto. Obviamente, el tiempo necesario para llegar a este punto serán diferentes, dependiendo del número de células inyectadas, en general, estamos buscando a una concentración de células que se alcance el máximo crecimiento del tumor permitida dentro de 30-60 días. Un crecimiento más rápido puede hacer que sea difícil alcanzar las concentraciones terapéuticas antes de la terminación de la experimentación y / o evitar la acumulación de suficientes puntos de datos de imágenes de bioluminiscencia en el curso de los experimentos. Un curso de tiempo de más de 60 días realiza el ajuste de parámetros experimentales difíciles de manejar y prolonga innecesariamente la duración de los experimentos previstos. Por último, también quisiera señalar que hemos utilizado esta metodología ortotópico xenoinjertos con ST88-14 células injertadas en ratones NIH III para demostrar la eficacia terapéutica de tamoxifeno 6. Una descripción detallada de los métodos que utilizan habitualmente para evaluar los efectos de posibles agentes terapéuticos en xenoinjertos ortotópico se pueden encontrar en el manuscrito. También se ha demostrado que las células neurofibroma puede ser injertadas con éxito en los nervios periféricos 12, lo que sugiere que, con modificaciones, los procedimientos descritos en este protocolo se puede utilizar para realizar los ensayos preclínicos con posibles agentes terapéuticos dirigidos contra la neurofibromas.

<table><tbody><tr><td>Ratones SCID outbred Foxchase</td><td>Charles River Laboratories</td><td>#236</td><td></td></tr><tr><td>Ratones NIH III</td><td>Taconic</td><td>#NIHBNX</td><td></td></tr><tr><td>Ratones NOD-SCID&amp;#947;</td><td>Jackson Laboratory</td><td>#005557</td><td></td></tr><tr><td>Desprendedor celular (Cell Stripper)</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-056-cl</td><td></td></tr><tr><td>Adhesivo quirúrgico Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton</td><td>Hamilton Co</td><td>#80030</td><td>10 &amp;#x03BC;L de volumen</td></tr><tr><td>Agujas para jeringa Hamilton</td><td>Hamilton Co</td><td>#7803-05</td><td>33 Ga., 0,5 pulgadas, PT4 (hecho a medida)</td></tr><tr><td>Etiquetas para orejas</td><td>National Band and Ear Tag Co.</td><td>1005-1</td><td></td></tr><tr><td>Pomada oftálmica</td><td>Dechra</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr></tbody></table>

xenotrasplante ortotópico de los derechos humanos-luciferasa tagged células malignas del tumor vaina de nervio periférico para in vivo pruebas de candidatos a agentes terapéuticos

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

Aunque en las pantallas in vitro son esenciales para la identificación inicial de posibles agentes terapéuticos, una evaluación rigurosa de la capacidad del medicamento para inhibir el crecimiento del tumor debe realizarse en un modelo animal adecuado. El tipo de modelo animal que es el mejor para este propósito es un tema de intensa discusión. Cierta evidencia indica que los ensayos preclínicos que evaluaron los efectos de drogas en los tumores que surgen en ratones transgénicos son más predictivos de los resultados clínicos y lo que los agentes un candidato terapéutico a menudo se prueba en estos modelos. Desafortunadamente, los modelos transgénicos no están disponibles para muchos tipos de tumores. Además, los modelos transgénicos a menudo tienen otras limitaciones como la preocupación en cuanto a qué tan bien los modelos tumorales de ratón de su contraparte humana, penetrancia incompleta del fenotipo tumoral y una incapacidad para predecir cuando los tumores se desarrollan. En consecuencia, muchos investigadores utilizan modelos de xenoinjerto (células tumorales humanas injertadas en ratones inmunodeficientes) para ensayos preclínicos en su caso los modelos tumorales transgénicos no están disponibles. Incluso si se dispone de modelos transgénicos, a menudo asociado con los modelos de xenoinjerto como el último de facilitar la rápida determinación de los rangos terapéuticos. Además, esta asociación permite una comparación de la eficacia del agente en los tumores de transgénicos y genuina células tumorales humanas. Históricamente, los xenoinjertos ha sido a menudo realiza mediante la inyección de células tumorales por vía subcutánea (xenoinjertos ectópico). Esta técnica es rápida y reproducible, relativamente barata y permite la cuantificación continua de crecimiento tumoral durante el período terapéutico 2. Sin embargo, el espacio subcutáneo no es el microambiente normal para la mayoría neoplasias y los resultados así obtenidos con xenoinjerto ectópico puede ser engañoso debido a factores tales como la ausencia de órganos específicos de la expresión de los tejidos del huésped y los genes del tumor. Así, ha sido fuertemente recomendado que los estudios de injerto ectópico ser sustituido o complementado con estudios en los que las células de tumores humanos son injertados en su tejido de origen (xenoinjertos ortotópico) 2. Desafortunadamente, la implementación de esta recomendación es a menudo frustrado por el hecho de que las metodologías ortotópico xenoinjertos todavía no se han desarrollado para muchos tipos de tumores. Los tumores malignos de la vaina nerviosa periférica (MPNSTs) son sarcomas muy agresivos que se producen de forma esporádica o en asociación con neurofibromatosis tipo 1 y 3 con más frecuencia se plantean en el nervio ciático 4. Aquí se describe un método técnicamente sencillo en el que luciferasa de luciérnaga-etiquetados células MPNST humanos orthopically transplantados en el nervio ciático de ratones inmunodeficientes. Nuestro enfoque para evaluar el éxito del procedimiento de injerto en los animales y la asignación al azar posteriores no sesgada en los grupos de estudio también se examina.

Un método de injerto de forma fiable la luciferasa-etiquetados humanos malignos de los nervios periféricos células del tumor de la vaina en el nervio ciático de ratones inmunodeficientes se describe. El uso de imágenes de bioluminiscencia para demostrar establecimiento adecuado de los injertos de tumor y los criterios de segregación aleatoria de los animales en grupos de estudio también se discuten.

Xenotrasplante ortotópico de los Derechos Humanos-luciferasa Tagged células malignas del tumor vaina de nervio periférico para In vivo Pruebas de candidatos a agentes terapéuticos

Aunque los cribados in vitro son esenciales para la identificación inicial de agentes terapéuticos candidatos, es necesaria una evaluación rigurosa de la capacidad del fármaco para...

El objetivo general de este procedimiento es determinar si un agente terapéutico candidato inhibe eficazmente el crecimiento de células M-P-N-S-T injertadas en el nervio ciático de ratones inmunodeficientes. Esto se logra primero extrayendo las células tumorales de un frasco de cultivo, lavándolas y resuspendiéndolas en la concentración adecuada. El segundo paso del procedimiento consiste en exponer quirúrgicamente el nervio ciático e inyectarle 5.000 células.El siguiente paso consiste en determinar el éxito del injerto mediante imágenes in vivo basadas en luz, aleatorizando los CIN en grupos de estudio y comenzando la terapia con el agente terapéutico candidato. El paso final del procedimiento es recoger los tumores 30 días después del injerto y analizar los efectos que el agente terapéutico candidato tuvo sobre el tumor. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren si el agente terapéutico redujo el crecimiento tumoral mediante métodos como la comparación de los pesos tumorales, el análisis de las tasas relativas de proliferación mediante inmunotinción para KI 67 y la evaluación de los niveles de muerte celular tumoral en ratones control y tratados mediante ensayos TUNEL.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el injerto subcutáneo es que modela el microentorno normal, lo que representa mejor el crecimiento de M-P-N-S-T. Esta técnica será demostrada por Amy Turk, una técnica de mi laboratorio. Los ratones inmunodeficientes no desnudos se preparan el día anterior al injerto. Utilice una cortadora para afeitar el pelo de un ratón anestesiado, trabajando sobre una placa calefactora para mantener la temperatura corporal.Utilice un agente depilatorio químico para eliminar cualquier vello residual. Una vez eliminado todo el vello, coloque el ratón sobre una almohadilla calefactora en una jaula de aislamiento sin lecho hasta que se recupere completamente. El día del injerto, centrifugue las células a 3000 RPM durante cinco minutos.Retire el sobrenadante cuidadosamente y resuspenda el botón celular en DMEM 10 sin puromicina hasta una concentración final de cinco veces 10 a la tercera células por tres microlitros. Mantenga las células en hielo hasta que estén listas para su uso. Para comenzar, coloque un animal anestesiado sobre una almohadilla calefactora y aplique una pomada oftálmica en cada ojo.Coloque una etiqueta en la oreja con un número de identificación único en la oreja derecha de cada ratón. Para facilitar la identificación durante todo el estudio, coloque al animal sobre su estómago y separe sus patas traseras. Cubra al ratón con un campo estéril y exponga una ventana quirúrgica en el lugar donde se realizará el injerto.Aplique Betadina en el sitio quirúrgico con un aplicador de algodón comenzando en el centro del flanco y espiralando gradualmente hacia los bordes de la ventana quirúrgica. Luego se aplica etanol al 70 % en el sitio quirúrgico de la misma manera. Se repiten dos veces más aplicaciones consecutivas de Betadina seguidas de etanol.Saque las células del hielo y vortex suavemente o golpee ligeramente el tubo para resuspender las células sedimentadas. Utilice una pipeta para retirar 3,2 microlitros de la suspensión celular y expúlselos sobre un trozo de paraforma. Aspire tres microlitros de la suspensión celular en una jeringa Hamilton de 10 microlitros.Equipado con una aguja de calibre 33. Mantenga las células y la jeringa que contiene las células sobre hielo hasta el momento de usarlas. Utilice un mango de bisturí número cuatro, equipado con una hoja de bisturí número 22, para realizar una incisión a través de la piel del flanco justo por debajo y paralela al fémur.Abrir la incisión cutánea con la pinza quirúrgica para exponer el músculo subyacente. Utilizar un par de tijeras de punta fina para realizar una disección roma a través de la fascia que recorre la longitud de la pierna y exponer el nervio ciático, que se encuentra debajo de una estructura lineal blanca del grosor aproximado de un hilo grueso, trabajando bajo un microscopio. Usar un par de pinzas curvas de punta fina para disecar cuidadosamente por debajo del nervio, liberándolo del músculo subyacente.Deje la pinza en su lugar para mantener el nervio elevado y aislado cuidadosamente. Introduzca la aguja de la jeringa Hamilton en el nervio, intentando mantener el ángulo de inyección lo más paralelo posible al nervio, para no perforar hasta el lado inferior. Una vez que la aguja esté correctamente posicionada dentro del nervio, relaje la tensión producida por la pinza e inyecte lentamente las células durante un período de 45 a 60 segundos. Una inyección lenta es esencial para prevenir el reflujo de células tumorales, lo que resultaría en su pérdida.Después de que todas las células hayan sido inyectadas con éxito, retire lentamente la aguja para minimizar la pérdida del material inyectado. Una vez finalizada la inyección, retire la pinza quirúrgica y las pinzas. Luego, coloque cuidadosamente el nervio de nuevo en su ubicación original.Cierre la incisión con pegamento quirúrgico vet bond, sosteniéndola con pinzas durante aproximadamente 20 segundos para permitir que el pegamento se seque. Coloque al animal en una jaula calentada sin cama hasta que se recupere completamente. Monitoree la salud de los ratones.Los ratones se eliminan del estudio diariamente. Si la carga tumoral supera el 10% del peso corporal normal del animal o la pérdida de peso excede el 20%, para determinar el éxito del procedimiento, realice imágenes de bioluminiscencia uno y tres días después del injerto. Inyecte a un ratón 2,5 miligramos de luciferina y coloque al animal anestesiado sobre la plataforma de imagen con calefacción.Se detecta la emisión de luz procedente de la luciferasa de luciérnaga expresada en el tumor 10 minutos después de la inyección del sustrato. Utilizando el software de Xeno Gen, configure los tiempos de adquisición de imágenes en un rango de un segundo a 10 minutos. A continuación, tome fotografías en blanco y negro de los ratones y aplique pseudocolor.La escala de bioluminiscencia se superpone a estas imágenes para proporcionar una medida de la intensidad de emisión de luz. Para ser elegibles para inclusión en una cohorte de ensayo preclínico, los ratones deben presentar una señal de bioluminiscencia detectable tanto un día como tres días después del injerto, y la intensidad de la señal debe aumentar entre el día uno y el día tres. Aquí se muestra un aumento progresivo típico de la bioluminiscencia observado entre uno y 18 días después del injerto en un xenoinjerto ortotópico correctamente establecido en un ratón nu.Observe la similitud en las señales detectadas dentro de la región de interés de diferentes ratones. La reimagen a los 10 y 18 días posteriores al injerto muestra que las señales bioluminiscentes aumentan progresivamente en el sitio del injerto en ratones individuales. La cuantificación de las señales bioluminiscentes observadas entre uno y 24 días después del injerto muestra que, aunque estas señales aumentan progresivamente, el crecimiento tumoral se acelera notablemente en las etapas posteriores del período de estudio.Dado el crecimiento agresivo de M pns ts, las células tumorales injertadas a menudo atraviesan las barreras normales del nervio e invaden tejidos adyacentes. Esta micrografía del sitio del injerto muestra el crecimiento tumoral y la invasión focal en el músculo esquelético adyacente. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en un ratón en 10 minutos si se realiza correctamente.

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Luciferasa modificados xenoinjertos de tumores humanos el cerebro puede ser establecida por vía intracraneal en ratones atímicos, con posterior seguimiento del crecimiento del tumor y la respuesta a la terapia que utiliza imágenes de bioluminiscencia. En combinación con el análisis de supervivencia, la supervisión de bioluminiscencia es una herramienta esencial para la investigación pre-clínica de las terapias que se consideran para el tratamiento de tumores cerebrales.

El establecimiento de xenoinjertos de tumor cerebral intracraneal, con posterior análisis del crecimiento tumoral y respuesta al tratamiento con imágenes de bioluminiscencia

Aquí describimos los métodos para construir, visualizar y cuantificar las reacciones bioluminiscentes de las enzimas luciferasa de luciérnaga y luciferasa de Renilla expresadas en células de cáncer de mama metastásico durante su crecimiento y metástasis. in vivo.

En vivo doble sustrato bioluminiscentes imagen

Se describe un método integrado para la implantación precisa, estereotáctica de las células de glioblastoma multiforme en el cerebro de ratones desnudos y posterior...

La implantación estereotáctica intracraneal y<em&gt; En vivo</em&gt; Radiología bioluminiscente de xenoinjertos de tumores en un sistema modelo de ratón de glioblastoma multiforme

Una mejor comprensión de la biología del cáncer de páncreas es una necesidad vital para permitir el desarrollo de mejores opciones terapéuticas para el tratamiento de cáncer de páncreas. Para hacer frente a esta necesidad, se demuestra un modelo ortotópico de cáncer de páncreas que permite la monitorización no invasiva de la progresión del cáncer...

Modelo ortotópico bioluminiscente de la progresión del cáncer de páncreas

GL261 proporcionan un modelo animal inmunocompetente útil de glioblastoma. Los objetivos de este protocolo son demostrar las técnicas adecuadas para monitorizar el crecimiento tumoral intracraneal mediante imágenes de bioluminiscencia in vivo, y verificar la utilidad de las células GL261 modificadas con luciferasa para el estudio de la inmunología tumoral y los enfoques inmunoterapéuticos para el tratamiento del glioblastoma.

La bioluminiscencia de imágenes de un Modelo inmunocompetentes Animal para Glioblastoma

Imágenes de bioluminiscencia es una herramienta bien conocida para la localización de tumores y metástasis, pero la cuantificación de estas imágenes a menudo requiere cálculos complejos e instrumentos particulares. Se describe el método luminoscore de usar fácil, sobre la base de condiciones de adquisición precisas, que no requiere de cálculos, y que permite la carga tumoral y la respuesta al tratamiento a ser monitoreados en modelos de ratón.

Método de cuantificación del tumor bioluminiscencia-base para la progresión tumoral Monitoreo y efectos del tratamiento en modelos de ratón linfoma

Aquí, presentamos un protocolo utilizar inyección guiada por ultrasonido de las células de (ES) el sarcoma de Ewing y neuroblastoma (NB) (estableció líneas celulares y células tumorales derivados del paciente) en sitios biológicamente relevantes para crear modelos preclínicos fiables para el cáncer investigación.

Utilización de ultrasonido guiado implantación celular dirigida de tejido para el establecimiento de xenoinjertos de tumores metastásicos biológicamente relevantes

Aquí utilizamos bioluminiscente, rayos x y emisión de positrones la tomografía/computado tomografía la proyección de imagen para estudiar cómo inhibidor mTOR actividad impactos tumores mieloma engrafted de médula ósea en un modelo de xenoinjerto. Esto permite fisiológicamente relevantes, no invasivo y multimodales análisis del efecto anti-mieloma de tratamientos contra tumores mieloma médula engrafted en vivo.

Proyección de imagen de tomografía multimodal bioluminiscente y emisión positrónica tomografía/computacional de xenoinjertos de médula ósea del mieloma múltiple en ratones NOG

Describimos el trasplante intraparenquimatoso de células progenitoras neurales humanas transducidas con un vector informador dual que expresa la proteína fluorescente verde luciferasa (GFP) en el cerebro del ratón. Después del trasplante, la señal de luciferasa se mide repetidamente utilizando bioluminiscencia in vivo y células injertadas que expresan GFP identificadas en secciones cerebrales mediante microscopía de fluorescencia.

Trasplante intracerebral y seguimiento de bioluminiscencia in vivo de células progenitoras neurales humanas en el cerebro de ratón

Un desafío importante del desarrollo de nuevas terapias para el cáncer de pulmón incluye el modelado del microambiente tumoral a medida que la enfermedad regional progresa a la enfermedad metastásica. Aquí, describimos un método simple para establecer un modelo singénico ortotópico de cáncer de pulmón que permite el seguimiento in vivo de la enfermedad a lo largo del tiempo.

Un método mínimamente invasivo para generar un modelo de ratón ortotópico singénico de cáncer de pulmón

La neurofibromatosis tipo 1 (NF1) conduce a tumores benignos de la vaina de los nervios periféricos (neurofibromas) que requieren un microambiente nervioso específico para su crecimiento. Se desarrolló un modelo de xenoinjerto ortotópico optimizado, utilizando la inyección intraneural de células de Schwann humanas en ratones NSG. Este modelo recapitula los neurofibromas humanos y proporciona una plataforma valiosa para evaluar estrategias terapéuticas.

Un xenoinjerto ortotópico del nervio ciático para neurofibromatosis tipo 1 Neurofibromas

Aprende a realizar xenotrasplante ortotópico de células de tumor maligno de vaina de nervio periférico marcadas con luciferasa en ratones inmunodeficientes. Este método permite evaluar agentes terapéuticos mediante imagen de bioluminiscencia in vivo.

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