Name: FISH para el diagnóstico genético preimplantacional (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-23T18:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Aprende la técnica FISH para diagnóstico genético preimplantacional en embriones humanos in vitro. Este método permite detectar anomalías cromosómicas mediante hibridación de sondas fluorescentes y análisis microscópico.

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1. Lisis y Difusión de un núcleo de una biopsia de blastómeros <ol><li> Buffer de lisis celular de las células de la difusión (0,2% de Tween 20 en 0,01 M de HCl, pH 2,0) deben estar preparados 24 horas de antelación y se almacenan a -20 ° C. La preparación de 100 ml y filtrar 20 en un recipiente estéril de 30 ml universal, utilizando una aguja estéril jeringa de 20 ml y el filtro de la jeringa. Dispensar alícuotas de 1 ml en tubos de 1,7 ml 10-15 estéril de microcentrífuga, cierre y etiqueta de los tubos antes de la congelación. Es recomendable contar con dos lotes diferentes es el uso, el nuevo lote y el lote anterior, lo que ha sido probado y se puede utilizar si el nuevo grupo no es satisfactoria. </li><li> Descongele el tampón de lisis a temperatura ambiente 30 minutos antes de la biopsia. A efectos prácticos la temperatura de trabajo será entre la temperatura ambiente y temperatura de la mano. </li><li> Marca un círculo pequeño (aproximadamente 5 mm de diámetro) en la parte inferior de una diapositiva amina recubiertos (por ejemplo, Genetix) utilizando una pluma de diamantes y la etiqueta antes de la diapositiva con el número de caso, número de la diapositiva única, y la fecha de la biopsia. Utilice una diapositiva por separado para cada blastómero en orden numérico, y la etiqueta con el número de embriones. Las diapositivas deberán estar etiquetados con un lápiz duro como 4H, y "borrado" con un guante de látex para eliminar el polvo de grafito. </li><li> Coloque una pequeña cantidad de solución amortiguadora de lisis dentro del círculo. </li><li> La transferencia de la biopsia de blastómeros en el tampón de lisis. Si es necesario agregar solución amortiguadora de lisis dentro del círculo hasta que la célula comienza a lisar, lisis de la célula debe por completo y el citoplasma se dispersan antes de que se seque el buffer. </li><li> Observe el núcleo para asegurar que se mantiene dentro del círculo y no se pierde, y si el celular no tiene un núcleo o tiene múltiples núcleos, la biopsia otra celda. </li><li> Salga de la diapositiva se seque al aire a temperatura ambiente. </li></ol> 2. Hibridación in situ en un núcleo único blastómeros <ol><li> Prepare una serie de etanol (70, 90 y 100%) prepararse en agua destilada estéril. </li><li> Activar y configurar el bloque de calor (por ejemplo, Hybaid Omnislide o Hybrite Vysis) a 75 ° C. </li><li> Descongele las sondas, vortex y centrifugar. Los reactivos deberán ser testigo y se comprueba su correcto antes de hacer la mezcla de sondas. Pipeta volúmenes según lo especificado por el fabricante para hacer la mezcla de la sonda en un tubo de microcentrífuga de 0,65 ml estéril y agitar y centrifugar antes de su uso. El volumen total de la mezcla de la sonda debe ser suficiente para permitir que l 2 por núcleo para ser probado y se redondea con una precisión de 10 l para permitir un margen de seguridad. </li><li> Pre-lavado de los portaobjetos en jarras Coplin con tampón fosfato salino (PBS) (pH 7,0: 0,14 M NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) por 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague los portaobjetos dos veces en agua destilada estéril. </li><li> Deshidratar las diapositivas con la serie de etanol (70, 90 y 100%) durante 2 minutos cada uno, a temperatura ambiente y el aire seco. Asegúrese de que las diapositivas se sumerge por completo y si el polvo de grafito flota a la superficie, cubra con un paño limpio. </li><li> Registrar la posición del núcleo dentro del círculo mediante la visualización con un microscopio de contraste de fase. </li><li> Deshidratan con etanol al 100% durante 2 min a temperatura ambiente y el aire seco. </li><li> Aplicar 2 l de la mezcla de la sonda, y cubrir con un cubreobjetos de 9 x 9 mm (un cuarto de 18 x 18 mm cubreobjetos n º 1). </li><li> Sellar los bordes del cubreobjetos con goma de cemento (por ejemplo, goma de vaca, de corrección de la vaca). </li><li> Codenature las diapositivas en un bloque caliente a 75 ° C durante 5 minutos, y después se hibridan las diapositivas durante la noche (16-20 h) en una cámara húmeda a 37 º C. Mezcla de la sonda que consisten enteramente de las sondas centrómero (es decir, ligada al sexo de los casos), dará un resultado satisfactorio después de 60 minutos de la hibridación. </li><li> Prepare un baño de agua con suficientes recipientes de Coplin y el calor a 71 ° C. </li><li> Preparar un 0,4 x citrato salino estándar (SSC) de solución de lavado estrictas (pH 7,0 a 71 ° C, 0,06 M NaCl, 6 mm C 6 H 5 O 7 Na 3 .2 H 2 O) y el calor en el baño de agua. </li><li> Vierta 50 mL de lavado estrictas por frasco Coplin necesario y comprobar que la temperatura es de 71 ° C inmediatamente antes de su uso mediante un termómetro limpio. </li><li> Retire con cuidado el cemento de caucho de cada diapositiva y enjuagar el cubreobjetos con 4x SSC/0.05% de Tween 20 (pH 7,0) a temperatura ambiente. </li><li> Se lavan los portas en el lavado de 0,4 x SSC estrictos a 71 ° C durante 5 min. Lavado de no más de 6 diapositivas por jarra de Coplin. </li><li> Se lavan los portas en Tween20 4x SSC/0.05% a temperatura ambiente durante 2 min. </li><li> Si la mezcla contiene la sonda sonda indirectamente etiqueta (s), la fuga de las diapositivas de exceso de líquido y aplicar 20 L de anticuerpo conjugado con fluorescencia en un cuadrado de 20 x 20 mm de Parafilm. </li><li> Incubar en una cámara húmeda a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Retire el Parafilm y lavar de vez en Tween20 4x SSC/0.05% a temperatura ambiente durante 2 min. </li><li> Lavar dos veces durante 2 minutos en PBS unat la temperatura ambiente y de drenaje de las diapositivas. </li><li> Aplique 6 l de DAPI / Vectashield (160 ng de 4 ',6-diamidino-2-phenylindole dihidrocloruro de 1 mL de medio de montaje Vectashield, Vector Laboratories) a un 22 x 22 mm no. 0 cubreobjetos y se invierte el portaobjetos sobre el cubreobjetos. </li><li> Blot y sellar los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente. </li></ol> 3. Análisis utilizando un microscopio de fluorescencia debidamente equipados con los filtros adecuados para las sondas utilizadas. <ol><li> Señales de puntuación mediante la visualización directa utilizando un microscopio de fluorescencia y un solo filtros pasa banda para cada fluorocromo en el ensayo. Cada núcleo debe ser anotado por dos analistas. Como regla general, debe conducir a la puntuación de una sola señal en dos señales muy próximas entre sí menos de un dominio (la señal de ancho) de distancia, sin embargo, el juicio basado en la experiencia debe ser ejercido para interpretar las señales de diferente tamaño, intensidad, y la separación. </li><li> El uso del software de imágenes (por ejemplo, Isis, MetaSystems, Altlußheim, Alemania; CytoVision, Genetix) para capturar una imagen del núcleo de la confirmación del diagnóstico visual y archivo de imágenes como parte de un plan de garantía de calidad de laboratorio. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Metafase y núcleos en interfase de cultivo de linfocitos de sangre periférica debe ser examinado para confirmar que las sondas seleccionadas son específicas para los cromosomas de translocación, informativo de los puntos de ruptura (las sondas de hibridación subtelomere debe sólo a los segmentos de translocación y la sonda centrómero (s) a la céntrica segmento (s)) y las señales de los núcleos en interfase debe ser brillante y discreto. Anotar el número de señales para cada sonda en 100 núcleos en interfase de cada socio, se recomienda evaluar la eficiencia de la prueba. En este caso, dos señales se anotó en el 95% -99% de los núcleos de cada sonda. La figura 1 muestra una metafase y el núcleo de la interfase de una preparación para una translocación recíproca entre los brazos cortos de los cromosomas 5 y 9. Las señales en los núcleos en interfase de blastómeras de embriones debe ser brillante y discreto y anotó con distintos filtros de paso de banda de los colores utilizados. La figura 2 muestra un núcleo blastómero con un patrón de señal normal (2 copias de todos los loci a prueba), en consonancia con un complemento cromosómico normal o equilibrado para el cromosoma 5 y 9, y un núcleo con un patrón de señal anormal en consonancia con un producto de la translocación desequilibrada que ha monosomía (una copia) para el segmento translocado del cromosoma 5 y la trisomía (tres copias) para el segmento translocado del cromosoma 9. <img src="/files/ftp_upload/2570/2570fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Una extensión metafase y una interfase núcleo preparado a partir de cultivos de linfocitos de sangre periférica de un portador de una translocación recíproca entre los brazos cortos de los cromosomas 5 y 9, con puntos de interrupción en 5p14.3 y 9p24.1:. 46, XY, t (5 , 9) (p14.3;. p24.1) ISH t (5; 9) (5ptel48, 9ptel30 +; 9ptel30, 5ptel48 +, 9cen +). Sondas de FISH fueron seleccionados para ambos segmentos translocados (5p14.3 → 5pter, rojo Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed; 9p24.1 → 9pter, verde Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC) y el segmento centrado en el cromosoma 9 (9p24.1 → 9qter, azul Abbott CEP 9 alfa satélite SpectrumAqua). <img src="/files/ftp_upload/2570/2570fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Señales de la figura 2. Núcleos en interfase blastómero de tres días-embriones capturado utilizando un filtro diferente para cada fluorocromo y se fusionaron para formar una imagen compuesta. (A) dos señales para cada sonda que indica dos copias de cada lugar, lo cual es consistente con un complemento normal o equilibrado de los cromosomas de translocación. (B) Una luz roja, tres señales de color verde y dos señales de color azul indicando una copia del segmento translocado del cromosoma 5, tres copias del segmento translocado del cromosoma 9 y dos copias del segmento centrado del cromosoma 9, lo cual es consistente con la adyacente -1 segregación de la translocación que resulta en un producto desequilibrado con monosomía para 5p14.3 → 5pter y la trisomía para 9p24.1 → 9pter.

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<li>Wells, D., Alfarawati, S., Fragouli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+comprehensive+chromosomal+screening+for+embryo+assessment%3A+microarrays+and+CGH%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Use of comprehensive chromosomal screening for embryo assessment: microarrays and CGH.</a> Mol. Hum. Reprod. 14, 703-710 (2008).</li>
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</ol>

La aplicación de la hibridación in situ fluorescente (FISH) en una celda de un solo embrión (blastómero) presenta desafíos especiales tanto en los aspectos prácticos y en la interpretación del patrón de la señal. La célula de la biopsia debe ser extendido en un área predefinida en la diapositiva con el fin de facilitar su localización PESCADO siguientes; extremo cuidado se debe tener para garantizar que la célula se lisa, que el citoplasma se ha dispersado, y que el núcleo es visible e intacto, y, como el diagnóstico depende de los resultados de esta célula, puntuación e interpretación estricta directrices se deberían aplicar. Sin embargo, en manos experimentadas, el pescado es una técnica robusta para el diagnóstico genético preimplantacional (DGP) en la práctica clínica. El principio de la DGP por FISH es que se dirigen a sondas de ADN específicas marcadas con fluorocromos diferentes haptenos puede ser utilizado para detectar el número de copias de loci específicos, y por lo tanto para detectar desequilibrio cromosómicas asociadas con la segregación meiótica de redistribución de cromosomas (1), incluyendo robertsoniana translocaciones, translocaciones recíprocas, inversiones y reorganizaciones complejas (2). Los peces también pueden ser utilizados para seleccionar los embriones femeninos en las familias con la enfermedad ligada al cromosoma X, por lo que no hay ninguna prueba de la mutación específica (3, 4). Más polémico, el pescado ha sido utilizada para detectar aneuploidías cromosómicas esporádicas con el fin de tratar de mejorar la eficiencia de la reproducción asistida (5, 6), sin embargo, el valor predictivo de esta prueba con FSIH es probable que sea inaceptablemente bajo en la mayoría de la gente las manos y no se recomienda el uso clínico de rutina (7). Este artículo se centra en los aspectos técnicos y las limitaciones de FISH clínica aplicada a una sola célula diagnóstico. Los métodos de difusión y fijación de blastómeros independientes, incluyen metanol / ácido acético (5, 8), Tween / HCl (9), y una combinación de Tween / HCl y metanol / ácido acético (10). Las variaciones incluyen el tratamiento hipotónico de las células antes de la difusión y / o la pepsina y el tratamiento de paraformaldehído después de la fijación. El método debe ser validado adecuadamente para el laboratorio (14). El método de interpolación / HCl se describe en detalle en este artículo. El método de interpolación / HCl es técnicamente sencilla y altamente reproducibles en diferentes laboratorios. Este método puede ser utilizado para preparar los núcleos individuales para el diagnóstico FISH de la determinación del sexo y la redistribución de cromosomas con una precisión aceptable de diagnóstico (7). Mezcla de la sonda puede combinar directamente etiquetados y marcados indirectamente sondas y las sondas de diferentes fabricantes. Sondas para conocer las regiones cromosómicas polimórficos (11, 12), o que se sabe que hibridizan de forma significativa con otros cromosomas (13) se debe evitar, aunque se puede utilizar si se demuestra que ser específico y adecuado para PGD por las pruebas a las dos partes antes de la reproducción . Fluorocromos disponible / haptenos y estrategias para las sondas de la discriminación son los siguientes: Texas Red (TR), isotiocianato de fluoresceína (FITC), SpectrumGreen (Vysis), SpectrumOrange (Vysis), SpectrumAqua, sondas con biotina detectados con TR-avidina, FITC avidina-, o Cy-5 estreptavidina (visualizado usando un filtro FarRed), una mezcla de sondas rojas y verdes para producir una señal amarilla, una segunda ronda de hibridación y un tercer color creado por la captura secuencial de SpectrumOrange con un TexasRed y un filtro de SpectrumGold). Una sonda conjunto con tres sondas, específicas para las regiones del centrómero de los cromosomas X e Y y un autosoma, se recomienda para la determinación del sexo (14), la sonda autosómico se utiliza para establecer la ploidía y modo de diferenciar entre X trisomía (2n, de 47 años , XXX) y la triploidía (3n, 69, XXX), y entre tetrasomía X (48, XXXX) y tetraploides (4n, 92, XXXX). Una sonda típica situada a aplicar en este contexto es la mezcla AneuVysion Abbott que contengan alfa-satélite X, Y, y 18, este conjunto de la sonda se ha demostrado que tienen una tasa de polimorfismo muy bajo, y por lo tanto el tratamiento previo con el trabajo de los socios de reproducción no es necesario (14). La mezcla de sondas para cualquier reordenamiento específico debe: Lo ideal sería que contienen sondas al menos suficiente para detectar todos los productos que se espera de la reorganización con desequilibrio cromosómico. Si esto no es posible, la sonda se mezcla en los productos desequilibrada detectados han sido evaluados como no viables en un embarazo reconocible y es probable que tengan una prevalencia muy baja puede ser aceptable (14). Ser probado en cultivos de linfocitos metafases de ambas partes reproductivas. Por lo menos diez se extiende metafase deben ser examinados por la especificidad de la sonda, los polimorfismos y la hibridación cruzada, y, para el transportista reordenamiento cromosómico, para asegurarse de que las sondas de hibridación como se esperaba a los diferentes segmentos de la reordenación. Además, al menos 100 núcleos en interfase de estos preparados debe ser anotado para evaluar la especificidad de la señal, el brillo y discreto (14). Commercial sonda fija PGS están disponibles (por ejemplo, Abbott MultiVysion PB o PGT), dirigido a los cromosomas más frecuentemente encontrado para ser aneuploides en los productos de la concepción, y que comprende una sola sonda por cromosoma objetivo. Normalmente, el núcleo puede tener una segunda hibridación con sondas para los cromosomas adicionales que proporcionan un análisis de los cromosomas 13, 15, 16, 18, 21, 22, y XY (14). El valor predictivo de esta prueba con la difusión y la técnica de FISH se describe aquí es probable que sea inaceptablemente bajo en las manos de la mayoría de la gente y no se recomienda para el uso clínico de rutina (7, 15). Técnicas tales como la hibridación genómica comparativa (CGH) aplicada a células individuales son capaces de probar el número de copias de cada cromosoma (Wilton et al. 2001), y el uso de polimorfismos de nucleótido único (SNP) y las matrices de análisis cuantitativo (Wells et al . 2008) o &quot;karyomapping&quot; de genotipado (Handyside et al. 2009) son prometedoras técnicas alternativas para detectar aneuploidías cromosómicas. Sin embargo, el límite de la resolución y la precisión de desequilibrio segmento sigue siendo incierto y es probable que el pescado siguen siendo la técnica de elección para la participación de los reordenamientos cromosómicos en pequeños segmentos.

<table><tbody><tr><td>Ácido clorhídrico, 2,5 L</td><td>VWR international</td><td>101254H</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio, 5 kg</td><td>VWR international</td><td>443827W</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio, 250 g</td><td>VWR international</td><td>26764.232</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato monosódico anhidro, 500 g</td><td>VWR international</td><td>102494C</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato monopotásico, 500 g</td><td>VWR international</td><td>10203 4B</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de Hidróxido de Sodio, 500 g</td><td>VWR international</td><td>28245.265</td><td></td></tr><tr><td>Tween20, 500 mL</td><td>VWR international</td><td>663684B</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 2,5 L</td><td>VWR international</td><td>8.18760.2500</td><td>Derechos pagados</td></tr><tr><td>Citratro sódico trihidratado, 5 kg</td><td>VWR international</td><td>27833.363</td><td></td></tr><tr><td>Goma para vaca, 250 mL</td><td>Cow Proofings Ltd.</td><td>No disponible</td><td>Todavía se pueden encontrar existencias antiguas en tiendas de arte</td></tr><tr><td>DAPI/Antifade ES, 0,125&amp;mu;g/mL, 500 µl</td><td>Cytocell Ltd.</td><td>DES500L</td><td>150&amp;#x03BC;l vial rec&amp;rsquo;d con cada sonda Cytocell TEL</td></tr><tr><td>Barniz de uñas, 12 mL</td><td>Botas</td><td>10088316001</td><td></td></tr><tr><td>Láminas recubiertas con amina, 25</td><td>Genetix</td><td>K2615</td><td></td></tr><tr><td>DAPI, 0,1 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9542</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield, 10 mL</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>Texas-Red-avidina, 0,001 mL</td><td>Vector Laboratories</td><td>A-2016</td><td></td></tr><tr><td>FITC-avidina, 0,001 mL</td><td>Vector Laboratories</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina Cy-5, 0,001 mL</td><td>GE Healthcare</td><td>PA45001</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, 1,75 mL, caja de 500</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, 0,6 mL, caja de 1000</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-MCT-060-C-CS</td><td></td></tr><tr><td>Contenedores universales de 30 ml, caja de 400</td><td>Sterilin</td><td>128B</td><td>Disponible en NHS Supply Chain, n.º de catálogo KCP053</td></tr><tr><td>Bloque térmico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quemador de alcohol Enchufe para quemador de alcohol Mechero para quemador de alcohol</td><td>VWR international</td><td>451-0107 451-3112 451-3111</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidrio obstruidas</td><td>Fisher Scientific</td><td>PMK-300-052R</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Wild Heerbrugg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tejidos, 100 cajas</td><td>CADENA DE SUMINISTRO NHS</td><td>MJT058</td><td></td></tr><tr><td>Bandas de cultivo metálicas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bandejas de melamina plástica</td><td>VWR international</td><td>682-009</td><td></td></tr><tr><td>Horno</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boquilla para pipeta de boca</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>HAE3700</td><td></td></tr><tr><td>Tubo flexible</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa, 0,2&amp;mu;tamaño de poro de m, diámetro de 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FDM-340-010U</td><td></td></tr><tr><td>Pluma de diamante</td><td>VWR international</td><td>818-0021</td><td></td></tr><tr><td>Bloque calefactor para portaobjetos</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>HBOSBB</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de hibridación</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rollo de tejido</td><td>CADENA DE SUMINISTRO NHS</td><td>MJT004</td><td></td></tr><tr><td>Schieferdecker Jar</td><td>VWR international</td><td>631-9313</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de Coplin</td><td>VWR international</td><td>631-9331</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas, finas</td><td>VWR international</td><td>232-2123</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas, romas</td><td>VWR international</td><td>232-2113</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de precipitados de 1000 mL</td><td>VWR international</td><td>213-1642</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de contraste de fases</td><td>Nikon Instruments</td><td>E200</td><td></td></tr><tr><td>Tarjetas para transferencia sin fibra, caja de 100</td><td>Fisher Scientific</td><td>SDE1</td><td></td></tr><tr><td>Láminas de microscopio azules con superficie esmerilada, caja de 100</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3022</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos, 18x18 mm, No. 1, caja de 200</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3110</td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos, 22x22 mm, No. 0, caja de 200</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3104</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos, 22x50 mm, No. 0, caja de 100</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3206</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 mL, caja de 100</td><td>NHS Supply Chain</td><td>FWC045</td><td></td></tr><tr><td>Punta de pipeta de 1 mL, 10 estuches de 1000 unidades</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-T-1000-C-L-R</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>LEEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Equipamiento para subvenciones</td><td>W22</td><td></td></tr><tr><td>Termómetro de alcohol</td><td></td><td></td><td>Diversas fuentes disponibles</td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Jenway</td><td>3305</td><td></td></tr><tr><td>Electrodo de pH</td><td>VWR international</td><td>662-1759</td><td>Enchufe BNC para medidor de pH Jenway 3305</td></tr><tr><td>Agitador calefactor</td><td>Bibby</td><td>HC502</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur de 1 mL, caja de 500</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>PIP4202</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm, 50 mm x 75 m</td><td>VWR international</td><td>291-1214</td><td></td></tr></tbody></table>

fish para el diagnóstico genético preimplantacional

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis 

El diagnóstico de preimplantación genética (PGD) es una alternativa establecida para el diagnóstico prenatal, y consiste en la selección de embriones previo a la implantación de una cohorte generados por la tecnología de reproducción asistida (ART). Esta selección puede ser requerido por familiares enfermedad monogénica (fibrosis quística, por ejemplo), o por una pareja lleva un reordenamiento cromosómico (por ejemplo, una traslocación recíproca de dos vías). El DGP está disponible para las parejas que han tenido anteriormente los niños afectados, y / o en el caso de reordenamientos cromosómicos, abortos involuntarios recurrentes o infertilidad. Los ovocitos aspirados estimulación ovárica siguientes son fecundados por inmersión en vitro en el semen (FIV) o inyección intracitoplasmática de espermatozoide un individuo (ICSI). Pre-implantación el estadio de división de embriones se realiza una biopsia, por lo general por la eliminación de una sola célula en el día 3 después de la fertilización, y la célula de la biopsia se analiza para establecer el estado genético del embrión. Hibridación in situ fluorescente (FISH) en los núcleos de las células de la biopsia fija con el objetivo específico de sondas de ADN es la técnica de elección para detectar desequilibrios cromosómicos asociados con reordenamientos cromosómicos, y para seleccionar los embriones femeninos en las familias con la enfermedad ligada al cromosoma X para el que no se no hay mutación específica de la prueba. De pescado también ha sido utilizado para seleccionar embriones de aneuploidías cromosómicas espontáneas (también conocido como SPG o PGD AS-) con el fin de tratar de mejorar la eficiencia de la reproducción asistida, sin embargo, el valor predictivo de esta prueba con la difusión y la técnica de FISH se describe aquí es probable que sea inaceptablemente bajo en las manos de la mayoría de la gente y no se recomienda para el uso clínico de rutina. Se describe la selección de sondas adecuadas para una sola célula FISH, las técnicas de difusión de los núcleos de blastómeros, y la hibridación in situ y la puntuación de la señal, aplicado al DGP en un entorno clínico.

En este artículo se describe la selección de sondas adecuadas para una sola célula FISH, las técnicas de difusión de los núcleos de blastómeros, y la hibridación in situ y la puntuación de la señal, aplicadas al diagnóstico genético preimplantacional (DGP) en un entorno clínico.

FISH para el diagnóstico genético preimplantacional

El diagnóstico genético preimplantacional (DGP) es una alternativa establecida al diagnóstico prenatal y consiste en la selección de embriones preimplantacionales a partir de un...

El objetivo de este procedimiento es utilizar la técnica de hibridación fluorescente in situ en dos fases para determinar el estado de los cromosomas sexuales o de translocación de embriones humanos in vitro con riesgo de anormalidad genética. Esto se logra lisando una sola célula obtenida mediante biopsia de un embrión del día tres sobre un portaobjetos de vidrio y secando al aire el núcleo. El segundo paso consiste en desnaturar el ADN y hibridar el ADN del núcleo diana con sondas de ADN marcadas con fluorocromos de diferentes colores.A continuación, se elimina la sonda en exceso mediante un lavado estricto y se tiñe el núcleo con un colorante fluorescente específico para ADN. El paso final consiste en observar el núcleo mediante un microscopio de fluorescencia y capturar imágenes digitales. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el número de copias de las regiones cromosómicas diana mediante microscopía de fluorescencia.Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades porque se encuentra en el límite mismo de la hibridación fluorescente in situ. Con 24 horas de anticipación, prepare el tampón de lisis celular para extender las células. Filtre la solución y distribuya alícuotas de un mililitro en 10 a 15 tubos estériles de microcentrífuga de 1,7 mililitros, ciérrelos y etiquételos antes de congelarlos a menos 20 grados Celsius, justo antes del procedimiento de biopsia.Descongele el tampón de lisis a temperatura ambiente. Marque con un círculo pequeño de aproximadamente cinco milímetros de diámetro en la parte inferior de una portaobjetos recubierta con amina utilizando un lápiz de diamante, y luego use un lápiz duro 4H para etiquetar previamente el portaobjetos como BLO con un guante de látex. Para eliminar cualquier polvo de grafito, utilice un portaobjetos separado para cada espejo de blaster en orden numérico.Ahora coloque un pequeño volumen de tampón de lisis dentro del círculo. Transfiera el biópsico destructor al tampón de lisis. Añada tampón de lisis según sea necesario para lisar la célula.Observe el núcleo para asegurarse de que permanezca dentro del círculo y no se pierda. Si la célula no tiene núcleo o tiene múltiples núcleos, realice una biopsia de otra célula. Deje que la preparación se seque al aire a temperatura ambiente.Primero, prelave las muestras en frascos coplán con solución salina tamponada con fosfato durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego, enjuague dos veces con agua destilada estéril, deshidrate con una serie de etanol durante dos minutos cada uno a temperatura ambiente y seque al aire. Asegúrese de que los portaobjetos estén completamente sumergidos y, si algún polvo de grafito flota en la superficie, absorba con un tejido limpio.Registre la posición del núcleo dentro del círculo visualizando con un microscopio de contraste de fases. Luego deshidrate las muestras con etanol al 100 % durante dos minutos a temperatura ambiente y seque al aire. Aplique ahora dos microlitros de la mezcla de sonda y cúbrala con un cubreobjetos de nueve por nueve milímetros.Selle los bordes del cubreobjetos con cemento de goma. Realice la desnaturación codificada. Incube en un bloque térmico a 75 grados Celsius durante cinco minutos, y luego hibride durante la noche en una cámara humidificada a 37 grados Celsius para cada frasco de acoplamiento.Equilibre 50 mililitros de solución de lavado estricto 0,4 veces SSC en un baño de agua a 71 grados Celsius. Coloque el frasco de lavado estricto y el frasco de acoplamiento vacío en el baño de agua a temperatura ambiente y caliente a 71 grados Celsius. Ajuste el pH del lavado estricto y viértalo en frascos de cochin. Proceda a retirar cuidadosamente el cemento de goma de cada portaobjetos y enjuague la cubierta con SSC 4 veces, 0,05 % Tween 20, pH 7, a temperatura ambiente.Lave las muestras en lavado estricto de SSC 0,4 veces a 71 grados Celsius durante cinco minutos, seguido de SSC 4 veces con 0,05 % Tween 20 a temperatura ambiente durante dos minutos. Para las sondas marcadas indirectamente, drene el exceso de líquido de los portaobjetos y aplique 20 microlitros de anticuerpo conjugado con fluorocromo debajo de un cuadrado de paraformo de 20 por 20 milímetros. Incube en una cámara humidificada a 37 grados Celsius durante 15 minutos.Retire la película de para y realice los siguientes lavados a temperatura ambiente durante dos minutos. Una vez con SSC cuatro veces con tween 20 al 0,05% y dos veces durante dos minutos con PBS. Después de drenar las laminillas, aplique seis microlitros de medio de montaje vector shield que contiene DPI a una de 22 por 22 milímetros.Numere el cubreobjetos con cero e invierta el portaobjetos sobre el cubreobjetos. Absorba el exceso y selle los bordes del cubreobjetos con esmalte transparente. Finalmente, analice las muestras mediante microscopía de fluorescencia.Califique cada núcleo por dos analistas independientes. También utilice software de imagen para capturar una imagen del núcleo con el fin de confirmar el diagnóstico visual y para archivar la imagen como parte del aseguramiento de calidad del laboratorio. Aquí, una extensión metafásica y un núcleo en interfase preparados a partir de linfocitos de sangre periférica indican un portador de una translocación recíproca entre los brazos cortos de los cromosomas cinco y nueve, con puntos de ruptura en cinco P 14.3 y nueve P dos, 4.1.Las sondas para FISH iluminan tanto los segmentos translocalizados como el segmento céntrico de las señales del cromosoma nueve. En núcleos en interfase de blastómeros de embriones del día tres, se pueden capturar imágenes que luego se fusionan para formar una imagen compuesta. Dos señales para cada sonda indican dos copias de cada locus, lo cual es consistente con un complemento normal o equilibrado.Para los cromosomas de translocación, las señales coloreadas indican una copia del segmento translocalizado del cromosoma cinco, tres copias del segmento translocalizado del cromosoma nueve y dos copias del segmento céntrico del cromosoma CH nueve. Estos datos son consistentes con un producto desequilibrado de monosomía para 5p14.3 hasta 5pt y trisomía para 9p24.1 hasta 9pt. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar una célula individual biopsiada de un embrión humano y preparar un núcleo individual utilizando la técnica de hibridación fluorescente in situ.Esto es importante para obtener resultados de prueba reproducibles y óptimos para determinar el complemento de cromosomas sexuales o el estado de translocación de un embrión.

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Investigación

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Medicine

Medicina

Función de los genes puede ser oscurecida en los experimentos de la pérdida de función de si hay una compensación por otro gen. El modelo de pez cebra ofrece un relativamente alto rendimiento medio para revelar la redundancia funcional como en embriones vivos.

Un enfoque de genética inversa para probar la redundancia funcional durante la embriogénesis

Este protocolo describe el método de trampa de genes inserción mutagénesis usando Gal4-VP16 como el reportero principal y GFP / RFP como reporteros secundarias en el pez cebra. Aproximadamente uno de cada diez-alta expresión de genes rendimiento pesquero F0 trampa progenie co-expresión de las buenas prácticas agrarias y RFP. El procedimiento de detección se puede escalar fácilmente para adaptarse al tamaño de la pantalla de laboratorio que realice la mutagénesis de inserción.

Gene reventado Usando Gal4 en pez cebra

El pez cebra es un poderoso sistema modelo para la biología del desarrollo y la investigación de enfermedades humanas debido a su similitud genética con los vertebrados superiores. Este protocolo describe una metodología para crear embriones haploides de pez cebra que se pueden utilizar para estrategias de detección directa para identificar mutaciones recesivas en genes esenciales para la embriogénesis temprana.

La producción de embriones de pez cebra mediante haploide<em&gt; In Vitro</em&gt; Fertilización

Manipulaciones transgénicas y la edición del genoma son críticos para probar funcionalmente las funciones de los genes y elementos cis-regulador. Aquí se presenta un protocolo de microinyección detallado para la generación de modificaciones genómicas (incluyendo construcciones mediadas por Tol2 fluorescentes transgén reportero, Talens, y CRISPRs) para el modelo emergente de pescado, el espinoso de tres espinas.

La microinyección de transgénesis y Genoma edición en tres espinas espinosos

Se presenta un protocolo de microinyección simple y eficiente para la edición de genes en embriones de bagre de canal usando el sistema CRISPR/Cas9. En este protocolo, guía RNAs y proteínas Cas9 fueron microinyectados en la yema de una célula de embriones. Este protocolo ha sido validada por la anulación de dos genes relacionados con la inmune de bagre de canal.

Microinyección de la proteína CRISPR/Cas9 en bagre de canal, Ictalurus punctatus, embriones de Gene Editing

Edición del genoma específica en el sistema modelo Danio rerio (pez cebra) ha sido facilitada enormemente por la aparición de enfoques CRISPR. Adjunto, describimos un protocolo robusto optimizado para la generación y la identificación de alelos derivados CRISPR absurdo que incorpora el análisis de movilidad del heterodúplex y la identificación de mutaciones mediante secuenciación de próxima generación.

Producción eficiente y genera identificación de CRISPR/Cas9 Gene Knockouts en el sistema modelo Danio rerio

Pez cebra se han utilizado como organismos modelo genética fiable en la investigación biomédica, especialmente con el advenimiento de las tecnologías de edición de gene. Cuando se esperan fenotipos larvales, identificación de extracción y genotipo de ADN puede ser difícil. Aquí, describimos un procedimiento eficiente de genotipado para larvas de pez cebra, por cola de recorte, tan pronto como 72 h post fertilización.

Extracción de ADN de alto rendimiento y genotipificación de 3dpf larvas de pez cebra por recorte de aleta

Aquí, introducimos un método de secuenciación de semiconductores para pruebas genéticas preimplantacionales para la aneuploidía (PGT-A) con las ventajas de un tiempo de respuesta corto, bajo costo y alto rendimiento.

Secuenciación de semiconductores para pruebas genéticas preimplantaciones para la aneuploidía

El desarrollo temprano depende de los productos heredados por la madre, y el papel de muchos de estos productos es actualmente desconocido. En este documento, describimos un protocolo que utiliza CRISPR-Cas9 para identificar fenotipos de efecto materno en una sola generación.

Determinación del papel de los genes expresados por la madre en el desarrollo temprano con crispants maternos

El protocolo presenta los procedimientos generales en el laboratorio requeridos en las pruebas genéticas preimplantacionales para la aneuploidía en una plataforma de secuenciación de próxima generación basada en semiconductores. Aquí presentamos los pasos detallados de la amplificación del genoma completo, la selección de fragmentos de ADN, la construcción de bibliotecas, la preparación de plantillas y el flujo de trabajo de secuenciación con resultados representativos.

Pruebas genéticas preimplantacionales para aneuploidías en una plataforma de secuenciación de próxima generación basada en semiconductores

Las tecnologías CRISPR-Cas han revolucionado el campo de la edición del genoma. Sin embargo, encontrar y aislar la edición de la línea germinal deseada sigue siendo un cuello de botella importante. Por lo tanto, este protocolo describe un método robusto para examinar rápidamente el esperma de pez cebra inyectado con CRISPR F0 para ediciones de la línea germinal utilizando técnicas estándar de PCR, digestión de restricción y electroforesis en gel.

Detección de espermatozoides para el aislamiento rápido de ediciones de la línea germinal en el pez cebra

Aprende la técnica FISH para diagnóstico genético preimplantacional en embriones humanos in vitro. Este método permite detectar anomalías cromosómicas mediante hibridación de sondas fluorescentes y análisis microscópico.

FISH para el diagnóstico genético preimplantacional

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