FISH para el diagnóstico genético preimplantacional

En este artículo se describe la selección de sondas adecuadas para una sola célula FISH, las técnicas de difusión de los núcleos de blastómeros, y la hibridación in situ y la puntuación de la señal, aplicadas al diagnóstico genético preimplantacional (DGP) en un entorno clínico.

El objetivo de este procedimiento es utilizar la técnica de hibridación fluorescente in situ dos para determinar el estado del cromosoma sexual o de translocación de embriones humanos in vitro con riesgo de anomalía genética. Esto se logra mediante lisis, una sola célula biopsiada de un embrión del tercer día en un portaobjetos de vidrio y secado al aire del núcleo. El segundo paso es codificar la naturaleza D e hibridar el ADN del núcleo objetivo con sondas de ADN marcadas con fluorocromos de diferentes colores.

A continuación, se elimina el exceso de sonda mediante un lavado estricto y el núcleo se tiñe con una tinción fluorescente específica de ADN. El paso final es observar el núcleo utilizando un microscopio de fluorescencia y capturar imágenes digitales. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el número de copias de las regiones cromosómicas objetivo a través de la microscopía de fluorescencia.

Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades porque está en el límite de la técnica de hibridación fluorescente in situ. Con 24 horas de anticipación, prepare el tampón de lisis celular para la propagación de las células. Filtre la solución y dispense alícuotas de un mililitro en 10 a 15 tubos de microcentrífuga estériles de 1,7 mililitros, cierre y etiquete los tubos antes de congelarlos a menos 20 grados centígrados justo antes del procedimiento de biopsia.

Descongele el tampón de lisis a temperatura ambiente. Marque un pequeño círculo de aproximadamente cinco milímetros de diámetro en la parte inferior de un portaobjetos recubierto de amina con un bolígrafo de diamante, y luego con un lápiz duro de cuatro H preetiquetó el portaobjetos BLO con un guante de látex. Para eliminar el polvo de grafito, use una corredera separada para cada espejo de chorro en orden numérico.

Ahora coloque un pequeño volumen de tampón de lisis dentro del círculo. Transfiera el blaster de biopsia al tampón de lisis. Agregue tampón de lisis según sea necesario para lisar la célula.

Observa el núcleo para asegurarte de que permanezca dentro del círculo y no se pierda. Si la célula no tiene núcleo o tiene varios núcleos, se realiza una biopsia de otra célula. Deje que el portaobjetos se seque al aire a temperatura ambiente.

En primer lugar, lavar previamente las muestras en frascos de coplan con solución salina tamponada con fosfato durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, enjuague dos veces en agua destilada estéril, deshidrate con una serie de etanol durante dos minutos cada uno a temperatura ambiente y se seque al aire. Asegúrese de que los portaobjetos estén completamente sumergidos y, si el polvo de grafito flota en la superficie, empapérelo con un pañuelo limpio.

Registre la posición del núcleo dentro del círculo visualizándolo con un microscopio de contraste de fase. A continuación, deshidratar las muestras con etanol al 100% durante dos minutos a temperatura ambiente y secar al aire. Ahora aplique dos microlitros de mezcla de sonda y cubra con un cubreobjetos de nueve por nueve milímetros.

Selle los bordes del cubreobjetos con cemento de caucho. Realice la naturing codificada. Pise un bloque de calor a 75 grados centígrados durante cinco minutos y luego hibrida durante la noche en una cámara humidificada a 37 grados centígrados para cada frasco de acoplamiento.

Equilibre 50 mililitros de solución de lavado estricta de 0,4 veces SSC en un baño de agua a 71 grados centígrados. Coloque la botella de lavado estricta y el frasco de acoplamiento vacío en el baño de agua a temperatura ambiente a temperatura ambiente a 71 grados Celsius pH, el lavado estricto y decantación en frascos de cochin. Proceda a retirar con cuidado el cemento de caucho de cada portaobjetos y enjuague el cubreobjetos con cuatro veces SSC 0.05%tween 20 pH siete a temperatura ambiente.

Lave las muestras en el lavado estricto de 0,4 veces SSC a 71 grados Celsius durante cinco minutos, seguido de cuatro veces SSC 0,05%Tween 20 a temperatura ambiente durante dos minutos. En el caso de las sondas marcadas indirectamente, drene los portaobjetos del exceso de líquido y aplique 20 microlitros de anticuerpo conjugado con fluorescencia bajo un cuadrado de 20 por 20 milímetros de paraforma. Incubar en una cámara humidificada a 37 grados centígrados durante 15 minutos.

Retire la película para y realice los siguientes lavados a temperatura ambiente durante dos minutos. Una vez cada cuatro veces SSC 0.05%tween 20 y dos veces durante dos minutos en PBS. Después de drenar los portaobjetos, aplique seis microlitros de medio de montaje de escudo vectorial que contenga DPI a un diámetro de 22 por 22 milímetros.

Cubra el número cero e invierta la corredera sobre la cubierta. Seque y selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente. Por último, analizar las muestras mediante microscopía de fluorescencia.

Puntúa cada núcleo por dos analistas independientes. Utilice también el software de imágenes para capturar una imagen del núcleo para confirmar el diagnóstico visual y para el archivo de imágenes como parte de la garantía de calidad del laboratorio. En este caso, una propagación de la metafase y un núcleo de interfase preparado a partir de linfocitos de sangre periférica indican un portador de una translocación recíproca entre los brazos cortos de los cromosomas cinco y nueve, con puntos de ruptura a los cinco P 14.3 y nueve P 2, 4.1.

Las sondas de peces iluminan tanto los segmentos trans localizados como el segmento central de las señales del cromosoma nueve. A partir del tercer día, los embriones pueden ser capturados y luego fusionados para formar una imagen compuesta. Dos señales para cada sonda indican dos copias de cada locus, lo que es consistente con un complemento normal o balanceado.

Para los cromosomas de translocación, las señales coloreadas indican una copia del segmento trans localizado del cromosoma, cinco, tres copias del segmento translocalizado del cromosoma nueve y dos copias del segmento central del cromosoma CH nueve. Estos datos son consistentes con un producto desequilibrado de hombre somi para cinco P 14.3 a cinco PT y trisomía para nueve P dos, 4.1 a nueve pt. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar una biopsia de una sola célula de un embrión humano y preparar un solo núcleo utilizando la técnica de hibridación fluorescente in situ.

Esto es importante para lograr resultados de prueba reproducibles y óptimos para determinar el complemento de los cromosomas sexuales o el estado de translocación de un embrión.