Ligadura de las arterias coronarias y la inyección intramiocárdica en un modelo murino de infarto

El objetivo general del siguiente experimento es demostrar los métodos microquirúrgicos para realizar la ligadura temporal o permanente de la arteria coronaria, así como la inyección intra miocárdica en el corazón del ratón. Esto se logra primero preparando y desinfectando el área quirúrgica. Luego, el ratón es intubado con un tubo de PE 90 para proporcionar ventilación por presión positiva durante la toracotomía.

Una vez aislada, la arteria coronaria puede ocluirse temporal o permanentemente. Además, se puede inyectar una sustancia en el corazón. Se obtienen resultados que muestran el grado de lesión impuesto al corazón según puntos finales histológicos y morfométricos, marcadores proteicos en tejido y suero, así como índices funcionales.

Mi nombre es TKA Rag y estoy en el Departamento de Fisiología de la Escuela de Medicina Brody de la Universidad East Carolina. El propósito de este video es demostrar los procedimientos microquirúrgicos utilizados para la ligadura temporal y permanente de la arteria coronaria, así como para la inyección intra miocárdica en el corazón de un ratón. Para comenzar, coloque instrumentos quirúrgicos estériles y aplicadores estériles de algodón de tres pulgadas sobre una almohadilla estéril.

A continuación, encienda un esterilizador de instrumentos para que esté listo para esterilizar los instrumentos entre cada cirugía individual. Para preparar al animal para la cirugía, aplique un lubricante estéril en los ojos de un ratón anestesiado. A continuación, retire el vello del lado izquierdo del tórax con un agente depilatorio, como nare.

Elimine cuidadosamente la crema depilatoria para evitar quemaduras químicas o dermatitis. Coloque el ratón sobre una placa isotérmica de fase delta fijada a una mesa de plexiglás. Inmovilice cada extremidad con cinta y coloque un hilo grueso debajo de los dientes superiores para mantener la mandíbula superior en su lugar.

Limpie el sitio quirúrgico con Betadine y luego con alcohol un total de tres veces. Utilice una luz de fibra óptica para iluminar la región del cuello y facilitar la visualización de la tráquea durante la inserción del tubo de PE. Una vez iluminada, inserte cuidadosamente el tubo a través de la boca.

Conecte el tubo a un ventilador para administrar ventilación con presión positiva. Una vez confirmada la ventilación mediante movimientos torácicos sincrónicos, fije la conexión al almohadillado con cinta adhesiva para mantenerla en su lugar. Durante la cirugía, utilice pinzas dentadas para levantar la piel hacia arriba y alejarla del tórax y realice una incisión de 1,5 centímetros en la piel paralela al esternón.

A continuación, use tijeras microcurvas Vana para cortar los músculos pectorales y hacer un pequeño orificio en el músculo intercostal. Después de retraer el músculo, use tijeras microrectas romas para cortar tres costillas. Utilice un espéculo para retraer la caja torácica.

Abrir suavemente la bolsa pericárdica para visualizar el corazón utilizando un portagujas TRO Viejo y una aguja de punta cónica con hilo, y colocar una sutura de polietileno debajo de la arteria coronaria descendente anterior izquierda para una ligadura temporal que pueda retirarse. Para la reperfusión controlada en el tiempo, cortar un trozo de 0,5 a un centímetro de tubo PE 90 y colocarlo sobre el corazón. Paralelo a la arteria coronaria, atar la sutura que pasa por debajo de la arteria coronaria al tubo. Después de un período de tiempo determinado, aflojar la ligadura para permitir la reperfusión; para realizar una oclusión permanente, no retirar la ligadura.

Se ata la ligadura pasada por debajo de la arteria coronaria. Debe observarse palidez y discinesia. Corte el extremo largo de la sutura para realizar inyecciones intramiocárdicas e inserte una aguja estéril de calibre 30 en la base del corazón por encima de la zona lesionada y hacia la derecha de la ligadura.

Avance la aguja hasta la zona de lesión y retráigala ligeramente para que la bisel se vea aproximadamente en la zona límite. Inyecte una pequeña cantidad de la solución y mantenga la aguja en su lugar. Retire la jeringa otros uno a tres milímetros e inyecte el resto de la solución.

Mantenga la jeringa en su lugar hasta que la sangre formada por la solución se disipe. Una vez disipada, retire la aguja. Si ocurre sangrado, presione suavemente un aplicador con punta de algodón sobre el sitio hasta que el sangrado se detenga.

Una vez completadas las manipulaciones del miocardio, retire los separadores de costillas y cierre la cavidad torácica con dos o tres suturas en punto de cruz. A continuación, cierre los músculos pectorales con dos o tres suturas en punto de cruz. Aplique una a tres gotas de 0,25%marking en solución salina estéril sobre el músculo y utilice dos o tres suturas en punto de cruz adicionales para cerrar la piel.

Retire el ratón del ventilador y asegúrese de que tenga una respiración rápida y superficial rítmica. Inyecte 0,5 mililitros de solución salina estéril tibia en el espacio subcutáneo dorsal y coloque el ratón en una jaula que contenga una almohadilla calefactora hasta que recupere la movilidad. Para experimentos de supervivencia, los ratones se devuelven a sus jaulas de origen y se trasladan de nuevo al vivario hasta el momento del sacrificio.

Limpie los instrumentos quirúrgicos con etanol e insértelos en el esterilizador de cuentas para prepararse para la siguiente cirugía. Para recoger muestras con fines de análisis, aísle el corazón y punzón la región basal posterior del ventrículo con una aguja que contenga cloruro de potasio frío o una solución de dos tres monóxido de butano Dion. Inyecte lentamente la solución en la cámara hasta que el corazón se detenga en diástole. Retire el corazón y perfunda con PBS para eliminar cualquier sangre residual.

Una vez perfundido, sumerja el corazón en fijador; luego, el corazón se procesa e incluye según procedimientos de rutina. La lesión aguda provocada por la ligadura temporal puede visualizarse mediante tinción. En esta imagen, el colorante azul se distribuye en las regiones ocluidas del corazón, y la tinción con TTC marca el tejido metabólicamente viable.

En rojo, las áreas necróticas no se tiñen y permanecen pálidas. Se puede utilizar un software de imágenes para calcular el área en riesgo en función del ventrículo izquierdo y el área del infarto en función del área en riesgo. En este ejemplo, un corazón lesionado se corta transversalmente a través de la región del infarto, cuatro días después de un mi y se tiñe con hemat, hematina y eoin.

El asterisco denota necrosis del tejido, mientras que las flechas indican la tinción de colágeno del tejido de granulación con prose. El rojo serio y el verde rápido pueden utilizarse para medir la fibrosis intersticial, que se correlaciona con índices funcionales de rigidez de la pared. Esta imagen de un corazón de ratón cuatro semanas después de un infarto muestra el citoplasma en verde y las fibras de colágeno en rojo.

Esta serie de imágenes representa la distribución de seis microlitros de solución de colorante azul de Evans inyectados en la zona de borde del corazón tras la ligadura permanente de la arteria. Obsérvese que el colorante avanza en la dirección de la lesión, así como hacia la base, y también de forma transmural. Visualizar la arteria coronaria y ocluirla de forma confiable resulta muy difícil y requiere mucha práctica para alcanzar la pericia.

Es muy importante recordar durante el procedimiento evitar perforar los pulmones y, adicionalmente, evitar la extubación del animal durante las manipulaciones quirúrgicas.I.