Time-lapse de imágenes en vivo de la relación clonal con células progenitoras neurales en el cerebro anterior El desarrollo de pez cebra

El objetivo del siguiente experimento es observar el desarrollo in vivo de células progenitoras neurales individuales del prosencéfalo a través de imágenes en vivo de lapso de tiempo de embriones de pez cebra. Esto se logra mediante la electroporación de construcciones de ADN que codifican marcadores fluorescentes que etiquetan cuatro células progenitoras neurales cerebrales escasamente posicionadas. Los embriones electroporados se anestesian, se montan en aros de bajo punto de fusión y se obtienen imágenes con microscopía confocal de lapso de tiempo.

Los resultados muestran el desarrollo in vivo de una célula progenitora neural del prosencéfalo en particular. Este método puede proporcionar información sobre el desarrollo invivo de las células neuroprógenas de la foína. También se puede aplicar a otras regiones del sistema nervioso central como la membrana, la hein y la médula espinal.

La principal ventaja de este método o de los métodos existentes, como la inyección de ADN o ARN en una sola célula, es que se dirige precisamente al interés propio en cualquier momento dado del desarrollo. Este protocolo comienza el día anterior a la electroporación prevista. Por la mañana, recolectar 50 embriones fertilizados de peces cebra apareados, bañar los embriones en medio embrionario que contenga fenil, trea o PTU, incubar los embriones sumergidos durante 22 horas a 28,5 grados centígrados al día siguiente.

A las 22 horas después de la fecundación, los embriones están listos para ser electroporados. Comience recubriendo los embriones manualmente con pinzas finas. Transfiera los embriones recubiertos a 10 mililitros de solución de anillo de electroporación que contenga PTU, luego anestesiar los embriones.

A 420 microlitros de caldo de Trica a una concentración de cuatro miligramos por mililitro a la solución. Los embriones ya están listos para la electroporación para preparar las agujas de inyección necesarias para la electroporación. Los capilares de vidrio se extraen y sus puntas se rompen con pinzas para formar un punto de fusión bajo y agudo de 0,2.

También se necesitan soluciones agropecuarias, que incluyen una solución al 1% suspendida en anillos de electroporación, y una solución al 0,8% en medio embrionario para el montaje. Alicuone las dos soluciones agrícolas diferentes en tubos de microcentrífuga de dos mililitros y manténgalos listos en un bloque de calor a unos 37 grados centígrados. Este protocolo utiliza el sistema GAL four UAS para impulsar la expresión génica en las células progenitoras neurales.

Se utilizan dos plásmidos cuando expresa de forma ubicua GAL cuatro ff y el otro expresa GFP en respuesta a los cuatro ff de GAL. Ambos plásmidos se preparan mediante kits para utilizar los preparados, concéntrelos entre uno y dos microgramos por microlitro utilizando una precipitación de etanol de acetato de sodio en una solución de 10 milimolares de Tri cl. Después de determinar la concentración de plásmidos, diluya ambos plásmidos en una sola solución con agua libre de nucleasas hasta 500 nanogramos por microlitro.

A esta concentración, se clasificarán juntos para visualizar la entrega de la solución, teñirla con rojo de fenol al 10% del volumen total de la solución. La solución ya está lista para la electroporación y debe colocarse en hielo. El equipo de electroporación consiste en un microscopio de disección estereoscópica con un aumento máximo de 50x.

El equipo está equipado con un inyector de presión de aire, dos manipuladores de micras y un estimulador eléctrico. El electrodo del micromanipulador de la izquierda tiene electrodos bipolares paralelos de platino iridio personalizados justo antes de la electroporación, cargue la aguja de inyección con dos microlitros de solución de ADN y ajuste el volumen de inyección a cuatro nanolitros. A partir de este momento, el protocolo requiere práctica para perfeccionar el montaje, sumergir e inmediatamente extraer dos embriones de la solución agrícola de bajo punto de fusión al 1%.

Con una pipeta de vidrio, transfiera cada uno a su propia gota de agros en la plataforma o plato en la gota. Use una sonda de fibra para orientar suavemente los embriones a una posición dorsal hacia arriba antes de que el agro se solidifique. Esto hará que el prosencéfalo sea accesible tanto a los electrodos como a la aguja de microinyección.

Repita este proceso hasta que las 10 gotas estén cargadas con todos los embriones preparados. Inserte los electrodos en el aeros e inserte la aguja de microinyección en el ventrículo del prosencéfalo. Ahora inyecta cuatro nanolitros de mezcla de ADN.

Observe el flujo y esté atento a la hinchazón del ventrículo. Tan pronto como se observe la hinchazón, aplique dos de los 4 27 pulsos de 0,5 voltios de un milisegundo de duración cada uno. Estos cuatro pulsos deben entregarse en polaridad opuesta.

El resultado es el marcaje en mosaico bilateral de las cuatro células progenitoras neurales del cerebro. Ahora retire la aguja de inyección del prosencéfalo y mueva la etapa al siguiente embrión. Repita el proceso de inyección y electroporación en cada embrión restante.

Una vez que los 10 embriones hayan sido electroporados, vierta cinco mililitros de medio embrionario sobre los embriones para transferir los embriones. Pelar los aros con un bisturí microquirúrgico y pasarlos a un plato fresco que contenga 30 mililitros de medio embrionario. Antes de la obtención de imágenes, incube los embriones a 28,5 grados centígrados durante unas cuatro horas, cuatro horas después de la electroporación.

La señal EGFP es observable. Si se observan bajo un microscopio de disección epifluorescente en una o cinco horas después de la electroporación, seleccione los embriones con una expresión de EGFP altamente en mosaico pero fuerte en la región de cuatro cerebros. Transfiera los embriones seleccionados a 10 mililitros de medio y anestesiarlos con una adición de 420 microlitros de caldo trica a una concentración de cuatro miligramos por mililitro.

Las imágenes se realizarán en la platina de temperatura controlada de un microscopio confocal, equipado con objetivos verticales. Preparó el visor ajustando la temperatura del escenario a 28,5 grados centígrados. También precaliente el medio embrionario a 28,5 grados centígrados.

Para montar un embrión, use una pipeta de vidrio para sumergirlo brevemente en aros y colóquelo en el centro de una placa de cultivo con fondo de vidrio de 35 milímetros. Con una sonda de fibra, oriente suavemente los embriones a una posición dorsal hacia arriba antes de que el agro se solidifique y cúbralos con tres mililitros de medio precalentado. El embrión ahora está listo para imágenes en vivo de lapso de tiempo de intervalo fijo con un objetivo de inmersión en agua, aquí se muestran imágenes confocales de lapso de tiempo de una célula progenitora neural.

Con este método, podemos observar que esta célula migra y se divide dos veces entre 28,5 y 41,5 horas después de la fertilización. Al minimizar la potencia del láser y reponer el embrión, se pueden seguir tomando imágenes multimedia hasta 60 horas después de la fertilización. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una electroporación a células neuropregénicas marcadas genéticamente y en video y cómo manejar los embriones de electrodos.

Para la obtención de imágenes confocales a nivel de TimeLapse, una vez dominado, esta electroporación se puede realizar en menos de una hora si se realiza correctamente.