Name: Time-lapse de imágenes en vivo de la relación clonal con células progenitoras neurales en el cerebro anterior El desarrollo de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Aprende a realizar electroporación y microscopía confocal de tiempo real para estudiar células progenitoras neurales en el cerebro anterior de Danio rerio. Este método permite analizar el desarrollo clonal in vivo con alta resolución.

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Este trabajo fue apoyado por theNIH grantNS042626. Damos las gracias a Thorn Kurt y UCSF Nikon Imaging centro de asistencia con las imágenes.

1. Preparación de los embriones de pez cebra <ol><li> Dos días antes de la electroporación, creado jaulas de apareamiento de los peces de tipo salvaje con divisores para separar los machos de las hembras. </li><li> Un día antes de la electroporación, tire de los separadores en el apareamiento de las jaulas del día anterior. </li><li> Recoger los embriones e incubar 50 embriones fecundados en el medio de 30 ml que contienen embriones 0,003% feniltiourea (PTU) a 28,5 ° C. </li><li> En el día de la electroporación, dechorionate los embriones de forma manual con unas pinzas finas (5 Inox, Dumont electrónico, Suiza), cuando los embriones llegan a la etapa de desarrollo de 22hpf. Luego, transferir los embriones al 3 de 10ml electroporación Ringer (180 mM NaCl, KCl 5 mM, CaCl2 1,8 mM, 5 mM HEPES pH 7,2) que contiene un 0,003% de PTU. </li><li> Añadir 420 l de valores tricaína (4mg/ml) a la electroporación de 10 ml de Ringer para anestesiar a los embriones. </li></ol> 2. Preparación para la electroporación <ol><li> Agujas de vidrio de la inyección fueron sacados de los capilares (1,2 mm de diámetro exterior, 0,9 mm de diámetro, con filamento) en un extractor de Flaming P897-Brown (Sutter Instruments, Novato, CA, EE.UU.). La punta de la aguja se rompió con las pinzas para obtener una línea de combate, como se muestra en la Figura 1D. El diámetro de la punta debe estar alrededor de 10 micras y el ángulo de inclinación debe ser alrededor de 30 grados. </li><li> Prepare un 0,8% y 1% de bajo punto de fusión de agarosa (Shelton Scientific, Inc. Catálogo # IB70050) en solución de Ringer electroporación. Alícuota de la solución de agarosa en tubos de 2 ml microcentrífuga. Mantener las alícuotas en un bloque de calor a ~ 37 ° C. </li><li> El sistema GAL4/UAS se utiliza para conducir la expresión de genes en las células progenitoras neurales de embriones electroporated. Dos plásmidos se utilizan: plásmido EF1α-GFF-PT2KXIG, en el que Gal4FF es impulsado por el promotor EF1α todas partes, y el plásmido UAS-E1B-EGFP PT2KXIG. </li><li> Prepare EF1α-GFF-PT2KXIG y UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG ADN plásmido con GenEluteTM HP plásmido Kit Midiprep (Sigma). </li><li> Los plásmidos se concentra entonces en acetato de sodio / etanol precipitación a la concentración final de 2.1 mg / l en 10 mM Tris Cl (pH 8,5). </li><li> Mezcla de los dos plásmidos y diluir con nucleasa libre de H2O a una concentración final de 500 ng / l para cada plásmido. Además de rojo fenol (diluido volumen 1 / 10 en total) a la solución es el preferido para la visualización de la entrega. Mantenga la solución de ADN en el hielo. </li><li> Justo antes de la electroporación, retrocarga la aguja de inyección con dos l solución de ADN y ajustar el volumen de inyección de 2 nl. </li></ol> 3. Electroporación <ol><li> Un microscopio de disección stero (Zeiss Stemi 2000 con una ampliación máxima de 50x), una presión de inyector de aire (Narishige IM 300 microinyector), dos micromanipulador (WPI M3301R, Instrumentos del Mundo de precisión, Sarasota, FL, EE.UU.), y un estimulador eléctrico (SD9 pulso cuadrado estimulador Grass Tlefactor, West Warwick, Rhode Island, EE.UU.) se configuran como se muestra en la Figura 1. </li><li> Para montar los embriones, se sumergen dos embriones en el 1% bajo punto de fusión de agarosa. Inmediatamente después, la toma de embriones a partir de la agarosa con una pipeta de vidrio. </li><li> Colocar los embriones en una tapa de plástico invertida placa de Petri en gotas individuales de agarosa. Orientar a los embriones con cuidado con una sonda de fibra a una posición dorsal, antes de la agarosa solidifica de manera que el cerebro anterior es accesible tanto para los electrodos y la aguja de microinyección (fig. 1B). Los embriones se debe montar en gotas individuales de agarosa. </li><li> Manipular los electrodos con el micromanipulador izquierda. Introducir los electrodos en la agarosa, como se muestra en la Figura 1B. Electrodos de platino iridio personalizado paralelo bipolar 125 micras de diámetro y espaciados 500 m además se utilizan para la electroporación (FHC, catálogo # PBSA0575). </li><li> Inserte la aguja de microinyección en el ventrículo del cerebro anterior y se inyecta la mezcla de ADN 4nl, como el flujo de líquido de color rojo y la inflamación del ventrículo puede ser observado. </li><li> Inmediatamente, un 28,5 V pulso que dura milisegundos 1 se aplicó de forma manual. Luego invertir la polaridad y aplicar una mayor 28,5 V pulso que dura una milésima de segundo. Esto se traducirá en el etiquetado de mosaico bilateral de las células progenitoras neurales del cerebro anterior. </li><li> Después de la electroporación de 10 embriones, se añade medio de embriones de 5 ml para cubrir los embriones y la cáscara de la agarosa con un cuchillo de microcirugía para liberar los embriones. </li><li> La transferencia de los embriones electroporated a un plato fresco de medio de 30 ml que contienen embriones 0,003% PTU y se incuba a 28,5 º C. </li></ol> 4. Montaje y Time-lapse de imágenes en vivo <ol><li> Unas 4 horas después de la electroporación, la señal de EGFP se puede observar si se observa bajo un microscopio de epifluorescencia de disección. </li><li> Cinco horas después de la electroporación, seleccionar los embriones con un mosaico muy pero la expresión EGFP fuerte en la región del cerebro anterior. </li><li> La transferencia de los embriones seleccionados para 10 ml medio de embriones que contienen 0,003% PTU. </li><li> Añadir 420 l de valores tricaína (4mg/ml) a la 10ml embrionarias medio to anestesiar a los embriones. </li><li> Para montar los embriones, se sumergen en un embrión de bajo punto de fusión del 0,8% de agarosa. A continuación, retire inmediatamente el embrión de la agarosa con una pipeta de vidrio y colocar el embrión en el centro de una placa de cultivo de vidrio de 35 mm de fondo (MatTek corporación, Parte # P35GC-1.5-10-C, <a href="http://www.glass-bottom-dishes.com/">www.glass-bottom-dishes.com</a> ) . </li><li> Orientar a los embriones con cuidado con una sonda de fibra a una posición dorsal, antes de la agarosa solidifica. </li><li> Coloque el plato correctamente en la etapa de control de temperatura del microscopio confocal, tal como se muestra en la figura 1C (Nosotros usamos un microscopio confocal Nikon C1 espectrales con objetivos arriba-derecha). Ajustar la temperatura a 28,5 ° C. </li><li> Añadir 3 ml de medio de 28,5 ° C precalentado embrionario que contiene 0,003% PTU para cubrir el embrión. El embrión ya está listo para la imagen. </li><li> Realizar time-lapse de imágenes en vivo con un intervalo fijo utilizando un objetivo de inmersión de agua. </li></ol> 5. Resultados representante Se muestra en la Figura 2 se seleccionan los marcos de un lapso de tiempo de imagen confocal en vivo de la electroporación de embriones de EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP en 22 HPF. <img src="/files/ftp_upload/2594/2594fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Aparato set-up. (A) El montaje de equipos de electroporación: la hierba SD9 estimulador pulso cuadrado (i), el micromanipulador izquierda (ii), los electrodos (iii), el Zeiss microscopio de disección (iv), la aguja de inyección (v), el micromanipulador derecho (vi) y el Narishige IM 300 microinyector (vii). (B) La posición relativa de los electrodos (i), el ventrículo del cerebro anterior (ii) y la aguja de inyección (iii). Tenga en cuenta la solución de ADN de color rojo ha sido inyectado en el ventrículo del cerebro anterior. (C) El montaje de imágenes en vivo en el microscopio Nikon C1 confocal: el controlador de temperatura (i), el agua mojando objetivo len (ii) y el embrión electroporated incrustado en bajo punto de fusión de agarosa en un recipiente de vidrio cultivo de fondo (iii) (D ) de la imagen de una aguja y tiró de corte para la microinyección de ADN. <img src="/files/ftp_upload/2594/2594fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Fotogramas seleccionados de un joven de 18 horas de lapso de tiempo de imagen confocal en vivo del embrión electroporated con EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP en 22 HPF. La superficie del ventrículo izquierdo es en la parte inferior de cada cuadro de imagen. Barra de escala representa 10 micras.

<ol><li>Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The development of neural stem cells.</a> Nature. 414, 112-117 (2001).</li>
<li>G#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of neurogenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 777-788 (2005).</li>
<li>Cerda, G. A., Thomas, J. E., Allende, M. L., Karlstrom, R. O., Palma, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+DNA%2C+RNA%2C+and+morpholinos+into+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Electroporation of DNA, RNA, and morpholinos into zebrafish embryos.</a> Methods. 39, 207-211 (2006).</li>
<li>Hendricks, M., Jesuthasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+methods+for+in+vivo%2C+whole+mount+and+primary+culture+analysis+of+zebrafish+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Dev%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based methods for in vivo, whole mount and primary culture analysis of zebrafish brain development.</a> Neural. Dev. 2, 6-6 (2007).</li>
<li>Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+electroporation+in+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae.</a> Methods Mol. Biol. 546, 145-151 (2009).</li>
<li>Tawk, M., Tuil, D., Torrente, Y., Vriz, S., Paulin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+adult+fish%3A+a+new+tool+to+study+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into adult fish: a new tool to study fin regeneration.</a> Genesis. 32, 27-31 (2002).</li>
</ol>

En este vídeo, se demuestra un método para time-lapse en vivo de células progenitoras neurales a nivel clonal en el cerebro anterior pez cebra en desarrollo. Hemos probado y modificar los protocolos existentes electroporación 4-6 a genética y fluorescencia etiqueta individual células progenitoras neurales. Un árbol genealógico compuesto de células de la progenie clonal relación se puede establecer, ya que sólo unas pocas células se marcaron con un poco de tensión relativamente baja de la electroporación. Adem...

time-lapse de imágenes en vivo de la relación clonal con células progenitoras neurales en el cerebro anterior el desarrollo de pez cebra

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Patrones precisos de la división, migración y diferenciación de las células progenitoras neuronales son cruciales para el desarrollo apropiado del cerebro y 1,2 función. Para entender el comportamiento de las células progenitoras neurales en el complejo en un entorno vivo, time-lapse de imágenes en vivo de las células progenitoras neuronales en un cerebro intacto es críticamente necesario. En este video, explotar las características únicas de embriones de pez cebra para visualizar el desarrollo de las células progenitoras neurales del cerebro anterior en vivo. Usamos la electroporación de genética y escasamente etiqueta individual células progenitoras neurales. En pocas palabras, construcciones de ADN que codifican para los marcadores fluorescentes se inyecta en el ventrículo del cerebro anterior de 22 horas después de la fecundación (HPF) embriones de pez cebra y pulsos eléctricos fueron entregados inmediatamente. Seis horas más tarde, los embriones de pez cebra electroporación fueron montadas con bajo punto de fusión de agarosa en placas de cultivo de fondo de cristal. Marcado con fluorescencia células progenitoras neurales fueron estudiados luego de 36 horas con intervalos fijos con un microscopio confocal con agua sumergiendo la lente objetivo. El presente método proporciona una forma para obtener información sobre el desarrollo en vivo de las células progenitoras neurales del cerebro anterior y se puede aplicar a otras partes del sistema nervioso central del embrión de pez cebra.

El vídeo de la actualidad muestra un método que aprovecha las ventajas de la combinación de electroporación y la microscopía confocal para realizar las imágenes en vivo en cada células progenitoras neurales en el cerebro anterior pez cebra en desarrollo.<em&gt; En vivo</em&gt; El análisis del desarrollo de las células progenitoras neurales del cerebro anterior a nivel clonal se puede lograr de esta manera.

Time-lapse de imágenes en vivo de la relación clonal con células progenitoras neurales en el cerebro anterior El desarrollo de pez cebra

Los patrones precisos de división, migración y diferenciación de las células progenitoras neurales son cruciales para el desarrollo y la función cerebrales adecuados1,2. Para ...

El objetivo del siguiente experimento es observar el desarrollo in vivo de células individuales progenitoras neurales del prosencéfalo mediante imágenes en vivo con lapso de tiempo de embriones de pez cebra. Esto se logra mediante la electroporación de constructos de ADN que codifican marcadores fluorescentes que etiquetan escasamente cuatro células progenitoras neurales cerebrales. Los embriones electroporados se anestesian, se montan en agarosa de bajo punto de fusión y se analizan mediante microscopía confocal de lapso de tiempo.Los resultados muestran el desarrollo in vivo de una célula progenitora neural específica del prosencéfalo. Este método puede proporcionar información sobre el desarrollo in vivo de células neuroprogenitoras. También puede aplicarse a otras regiones del sistema nervioso central, como la membrana, el encéfalo y la médula espinal.La principal ventaja de este método frente a métodos existentes, como la inyección de ADN o ARN en células individuales, es que permite dirigirse con precisión al interés propio en cualquier punto temporal del desarrollo. Este protocolo comienza el día anterior a la electroforesis planeada. Por la mañana, recolecte 50 embriones fertilizados de peces cebra apareados, sumerja los embriones en un medio embrionario que contenga fenil-tiourea o PTU e incube los embriones sumergidos durante 22 horas a 28,5 grados Celsius al día siguiente.A las 22 horas posteriores a la fecundación, los embriones están listos para ser electroporados. Comience recubriendo manualmente los embriones con pinzas finas. Transfiera los embriones recubiertos a 10 mililitros de solución fisiológica para electroporación que contenga PTU, luego anestesie los embriones.Añada 420 microlitros del stock de Trica a una concentración de cuatro miligramos por mililitro a la solución. Los embriones ya están listos para la electroporación. Prepare las agujas de inyección necesarias para la electroporación. Se estiran capilares de vidrio y sus puntas se rompen con pinzas para obtener una punta afilada de 0,2 puntos bajos de fusión.También se necesitan soluciones de agrobacterium, que incluyen una solución al 1% suspendida en solución fisiológica para electroforesis y una solución al 0.8% en medio embrionario para el montaje. Aliquotar las dos soluciones de agrobacterium diferentes en tubos microcentrífugos de dos mililitros y mantenerlas listas en un bloque térmico a aproximadamente 37 grados Celsius. Este protocolo utiliza el sistema GAL4-UAS para inducir la expresión génica en células progenitoras neurales.Se utilizan dos plásmidos cuando uno expresa de manera ubicua GAL cuatro ff y el otro expresa GFP en respuesta a GAL cuatro ff. Ambos plásmidos se preparan mediante kits, luego se concentran entre uno y dos microgramos por microlitro utilizando una precipitación con acetato de sodio y etanol en una solución de 10 milimolares de Tri cl. Después de determinar la concentración del plásmido, diluya ambos plásmidos en una única solución con agua libre de nucleasas hasta 500 nanogramos por microlitro.En esta concentración, se valorarán conjuntamente para visualizar la administración de la solución, teñida con rojo de fenol al 10% del volumen total de la solución. La solución ya está lista para la electroforesis y debe colocarse sobre hielo. El equipo de electroforesis consta de un microscopio estéreo de disección con un aumento máximo de 50 x.El equipo está equipado con un inyector de presión de aire, dos micromanipuladores y un estimulador eléctrico. El electrodo en el micromanipulador izquierdo tiene electrodos bipolares paralelos personalizados de platino-iridio justo antes de la electroforesis; recargue la aguja de inyección con dos microlitros de solución de ADN y ajuste el volumen de inyección a cuatro nanolitros. A partir de este momento, el protocolo requiere práctica para perfeccionar el montaje: sumerja e inmediatamente retire dos embriones de una solución de agarosa al 1% con punto de fusión bajo.Con una pipeta de vidrio, transfiera cada uno a su propia gota de agros sobre la plataforma o placa en la gota. Utilice una sonda de fibra para orientar suavemente los embriones en posición dorsal hacia arriba antes de que el agro se solidifique. Esto hará que el prosencéfalo sea accesible tanto para los electrodos como para la aguja de microinyección.Repita este proceso hasta que las 10 gotas estén cargadas con todos los embriones preparados. Inserte los electrodos en el aeros y coloque la aguja de microinyección en el ventrículo del prosencéfalo. A continuación, inyecte cuatro nanolitros de la mezcla de ADN.Observe el flujo y esté atento a la hinchazón del ventrículo. Tan pronto como se observe la hinchazón, aplique dos de 4 27 0,5 voltios de impulsos, cada uno de un milisegundo de duración. Estos cuatro impulsos deben administrarse con polaridad opuesta.El resultado es una marcación mosaico bilateral de las cuatro células progenitoras neuronales del cerebro. Ahora retire la aguja de inyección del prosencéfalo y mueva la platina al siguiente embrión. Repita el proceso de inyección y electroporación en cada embrión restante.Una vez que los 10 embriones hayan sido electroporados, vierta cinco mililitros de medio embrionario sobre los embriones para transferirlos. Pela los aros con un bisturí microquirúrgico y trasládelos a un nuevo recipiente que contenga 30 mililitros de medio embrionario. Antes de la obtención de imágenes, incube los embriones a 28,5 grados Celsius durante aproximadamente cuatro horas, cuatro horas después de la electroporación.La señal de EGFP es observable. Si se observa bajo un microscopio estereoscópico epifluorescente una hora o cinco horas después de la electroforesis, seleccione los embriones con expresión de EGFP fuerte pero altamente mosáica en la región del cerebro. Transfiera los embriones seleccionados a 10 mililitros de medio y anestesíeles con la adición de 420 microlitros de solución stock de trica a una concentración de cuatro miligramos por mililitro.La imagen se realizará en la platina controlada por temperatura de un microscopio confocal, equipado con objetivos verticales. Preparar el microscopio ajustando la temperatura de la platina a 28,5 grados Celsius. También precalentar el medio embrionario a 28,5 grados Celsius.Para montar un embrión, utilice una pipeta de vidrio para sumergirlo brevemente en aros y colóquelo en el centro de una placa de cultivo de 35 milímetros con fondo de vidrio. Usando una sonda de fibra, oriente suavemente los embriones en posición dorsal hacia arriba antes de que el agro se solidifique y cúbralos con tres mililitros de medio precalentado. El embrión ya está listo para la adquisición de imágenes vitales en intervalos fijos mediante un objetivo de inmersión en agua. Aquí se muestran imágenes confocales de lapso de tiempo de una célula progenitora neural.Mediante este método, podemos observar cómo esta célula migra y se divide dos veces entre las 28,5 y las 41,5 horas posteriores a la fertilización. Al minimizar la potencia del láser y reponer el medio del embrión, se pueden obtener imágenes durante hasta 60 horas posteriores a la fertilización. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo realizar una electroporación en células neurogénicas marcadas genéticamente y grabadas en video, así como de cómo manipular los embriones con electrodos.Para la obtención de imágenes confocales de nivel TimeLapse, una vez dominada, esta electroforesis puede realizarse en menos de una hora si se realiza correctamente.

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Time-lapse de imágenes en vivo de la relación clonal con células progenitoras neurales en el cerebro anterior El desarrollo de pez cebra (Video) | JoVE Journal

Time-lapse de imágenes en vivo de la relación clonal con células progenitoras neurales en el cerebro anterior El desarrollo de pez cebra

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